蛍光ペプチドZymography:ザイモグラムゲル中の蛍光基質を用いたプロテアーゼ活性検出のための改良技術

要約

出典:Deshmukh, A. A. et al.蛍光ペプチドジモグラフィーによるプロテアーゼ活性の検出。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、生体試料中のタンパク質分解活性を分析するために、電気泳動技術であるザイモグラフィーを行っています。

プロトコル

1. ペプチドZymographyゲル中の生体試料の電気泳動

1. 従来のザイモグラフィーサンプルバッファー(62.5 mM Tris-HCl、pH 6.8、25% グリセロール、4% SDS、0.01% ブロモフェノールブルー)にサンプルを溶解します。細胞および組織サンプルには、ウェルあたり~30 μgの総タンパク質が推奨され、MMP標準には50〜100 ngのタンパク質が推奨されます。
2. 400 mLの1x Tris-Glycine SDS Running Bufferをゲル装置に加えます。1ウェルあたり最大35 μLのサンプルをロードします。サンプルを120 V、4°Cで1.5時間、または分子量標準物質が目的のプロテアーゼがペプチド分離ゲル層(目に見えるオレンジ色)内にあることを示すまで分析します。
   手記：ほとんどのMMPとその亜種は、35〜100 kDaの範囲に収まります。分子量標準がそれらの重量がペプチド分離ゲル層内にあることを示している場合、電気泳動を停止できます。同じ原理は、分子量がわかっている他のクラスのプロテアーゼにも適用できます。より広い分子量で複数のプロテアーゼを検出することに関心がある場合は、分離ゲル層のサイズを小さくし、ペプチド分離ゲル層のサイズを大きくします。
3. 電気泳動後、プラスチックカセットからゲルを取り出し、2.5% Triton X-100、1 μM ZnCl₂、および5 mM CaCl₂を50 mM Tris-HCl、pH 7.5で含有する再生バッファーで、室温でそれぞれ10分間3回洗浄します。
4. 1% Triton X-100、1 μM ZnCl₂、5 mM CaCl 2、5 mM CaCl₂、50 mM Tris-HCl、pH 7.5 の 1% を含む現像緩衝液にゲルを移し、新鮮な現像緩衝液と交換し、ゲルを 37 °C で 24 時間穏やかに攪拌しながらインキュベートし、ゲルが溶液に完全に浸されていることを確認します。
5. 24時間後、蛍光ゲルスキャナー/イメージャーで適切な励起フィルターと蛍光フィルターを使用してゲルをイメージします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mm エンプティ ゲル カセット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NC2015
20% SDSソリューション	アンビオン	AM9820
3x Zymography サンプルバッファー	バイオ・ラッド	1610764
アジド-PEG3-マレイミドキット	[ケミストリーツール]	AZ107
PowerPac 基本電源	バイオ・ラッド	1645050
プレシジョンプラスプロテインデュアルカラースタンダード	バイオ・ラッド	〒161-0374
PrecisionGlide 皮下注射針	フィッシャーサイエンティフィック	14〜826