フォーカス超音波を用いたマイクロバブル媒介血液脳関門開口:超音波処理によりマウスの血液脳関門に局在性一過性開口を作製する技術

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 集束超音波装置

>注:説明されているセットアップは、市販のコンポーネントをベースにした社内で構築されたBBBディスラプションシステムであり、3Dプリントされたカスタムメイドのコーンと取り外し可能な定位プラットフォームが含まれています。このシステムはモジュール式に設計されているため、利用可能な機器や特定の用途に応じた変更が容易になります。このプロトコルは、マウスの脳の橋領域のより広い領域のソノポレーションの手順を説明しています。ターゲットの位置を調整することで、脳のさまざまな部分をターゲットにすることができます。本研究では、焦点距離75mm、開口60mm、焦点面積1.5×1.5×5mm(ピーク圧力のFWHM)の1MHzモノエレメント探触子を使用しました。トランスデューサーの焦点面は、動物の頭蓋骨を通じて、耳のバーと交差する水平面に配置されます。

1. げっ歯類のBBB開口部に適したトランスデューサーを選択してください.
   手記：マイクロバブルの特性と使用される周波数に基づいて、音響設定、特に機械的指数(MI)は変更される可能性があります。
2. 3Dプリントしたコーンに探触子を置きます。
3. コーンの下端に音響的に透明なマイラー膜を使用して、ビーム伝搬経路の音響結合を実現し、コーンを脱気水で満たします。
4. 図1に示すように、トランスデューサーを動物の上の電動リニアステージに取り付けて、トランスデューサーの自動垂直位置決めを可能にします。
5. 図 1 と図 2 に示すように、温度調節された加熱、バイトバーとイヤーバー、麻酔、マルチモダリティ基準マーカーなど、研究の要件に基づいて取り外し可能な定位プラットフォームを設計します。定位プラットフォームの取り付けは、2Dリニアステージシステムで構成されており、ビーム下の動物の正確な自動位置決め(< 0.1 mm)が可能です。
6. トランスデューサを図1に示すアコースティックエミッションチェーン(トランスデューサ、ファンクションジェネレータ、パワーアンプ)に接続します。
脳
7. の関心領域の正確なソノポレーションターゲティングと、針ハイドロフォンによって検出されたキャビテーションデータの収集を可能にするマルチモダリティ基準マーカーを検出するための画像処理パイプラインを考案します。
8. システムを校正し、定位プラットフォーム上の動物の垂直位置決めに対応してトランスデューサーの焦点を決定します。

2. 動物の調理法

>注:次のプロトコルはマウスに指定されていますが、ラットにも適用できます。これらの実験には、女性の胸部ヌードFoxn1-/-マウス(6〜8週齢)を使用しました。

1. 動物が動物施設で少なくとも1週間順応するのを許し、定期的に動物の体重を量ります。
2. ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)を皮下(s.c.)注射でFUS治療の30分前に投与し、鎮痛治療を開始します。.
3. 3% イソフルラン、2 L/min O₂ で動物に麻酔をかけ、動物が深く麻酔をかけられていることを確認します。全手順の間、動物に麻酔をかけたままにし、呼吸周波数と心拍数を監視して、必要に応じてイソフルランの濃度を調整します。
4. ドライアイを防ぎ、怪我を避けるために目の軟膏を塗ってください。
5. カミソリと脱毛クリームで頭のてっぺんの毛を取り除き、その後水で洗って残留物を取り除き、皮膚への刺激を避けます。
6. BLI腫瘍モデルを用いた実験では、150 μLのD-ルシフェリン(30 mg/mL)腹腔内(i.p.)を29Gインスリン注射器で注入し、BLI画像誘導を行います。
7. 26〜30Gの尾静脈カテーテルを挿入し、カテーテルと静脈を少量のヘパリン溶液(5 UI / mL)で洗い流します。血液凝固を避けるために、カテーテルにヘパリン溶液を充填します.
   手記：良好なカテーテル挿入は、カテーテルへの血液の逆流がある場合に見られます。塞栓を防ぐために、カテーテル内の気泡を避けてください。過度の注入圧力を避けるために、カテーテルの長さができるだけ短いことを確認してください。
8. 低体温を避けるために、動物を温度調節された定位プラットフォームに置きます.
   手記：低体温症は血液循環を低下させ、マイクロバブルの注射/循環や薬物の薬物動態に影響を与える可能性があります。
9. 動物の頭部を定位プラットフォームに固定し、イヤーバーとバイトバーを使用して固定します。体をストラップで固定し、動物の尻尾をプラットフォームにテープで固定します。

>3. In Vivo画像誘導集束超音波

>注:このプロトコルでは、10 msの持続時間、0.4のMI、1.6 Hzのパルス繰り返し周波数を持つ1 MHzの単素子トランスデューサ、40サイクル、240秒間が使用されました。このプロトコルは、無害なガスとして六フッ化硫黄(SF₆)を含むリン脂質によって安定化されたマイクロバブルに最適化されており、平均気泡径は2.5μmで、気泡の90%以上が8μm未満です。

1. 動物を装着した定位プラットフォームをイメージングモダリティ(BLIやX線など)に置き、動物の画像を撮影します。
2. マルチモダリティ基準マーカーを画像処理パイプラインと組み合わせて使用し、トランスデューサーの焦点に応じて動物の位置をマークします。
3. 取得したX線画像の上に脳の輪郭を配置するか、BLI画像を使用して腫瘍の中心を決定することにより、標的領域を決定します(図2)。脳の特定の部分の位置は、頭蓋骨のマーキングbregmaとlambdaを参照点として使用して、Paxinos Brain Atlasで指定されています。たとえば、ポンはラムダから x=-1.0、y=-0.8、z=-4.5 に位置しています。
4. 動物の鼻孔と口を粘着テープで覆い、超音波ゲルが呼吸を妨げるのを防ぎます。
5. 動物の頭の上に超音波ジェルを塗ります。
6. 動物の首の皮膚を引っ込め、針ハイドロフォンを超音波ゲルで滑らかにし、針ハイドロフォンを後頭骨のすぐ近くに置きます。
7. 画像処理パイプラインとフォーカスポイントを使用して、トランスデューサを正しい位置に誘導します。
8. 事前構成された設定を接続されているすべてのデバイスに適用し、関心のある脳の領域をターゲットにします。
   手記：研究課題に応じて、図2に示すように、腫瘍または脳領域を単一の焦点として、または体積形状としてソノポレーションできます。
9. メーカーの説明に従ってマイクロバブルを活性化します。120μL(5.4μg)のマイクロバブルのボーラスを1つ注入します。
10. 尾静脈カテーテルを生理食塩水で洗い流し、カテーテルの開口部を確認します。
11. マイクロバブルを注入し、インソネーションを開始します。
12. マイクロバブルキャビテーションをニードルハイドロフォンで記録します。
13. 超音波治療後に血管内造影剤または薬物を投与します。.用量、タイミング、計画は、研究の目的と薬によって異なります.
    手記：エバンスブルーは、BBBの開口部を評価するための一般的なカラーエージェントです。
14. 所定の時点まで、または人道的なエンドポイントの前まで動物を監視します。

図1:集束超音波のセットアップ。(A)集束超音波セットアップの概略図。(B)集束超音波セットアップの写真。このシステムは、1Dリニアステージ上にトップダウンで取り付けられたトランスデューサーと、自動3Dポジショニングのための2番目の2Dステージで構成されています。トランスデューサーは、水で満たされたビームコーンに組み込まれており、底部は音響的に透明なマイラー膜で閉じられており、動物の頭蓋骨に音を伝導します。トランスデューサはパワーアンプに接続され、パワーアンプは信号生成用の任意波形発生器(AWG)に接続されます。キャビテーション検出には、取り外し可能なハイドロフォンと低ノイズ電圧増幅器の組み合わせが使用されます。ハイドロフォンは後頭骨のすぐ近くに配置されます。外部ハイドロフォンは2mmのアクティブサーフェスを持ち、超音波ゲルと音響的に結合されています。励起パルスの高電圧信号と記録されたキャビテーション信号は、標準の200MHzオシロスコープでデジタル化され、オンザフライ処理とリアルタイム制御のために制御コンピュータ(図には示されていません)に中継されます。

図2:集束超音波ワークフロー。集束超音波システムの提案されたワークフローは、(A) 取り外し可能な定位プラットフォーム上の動物の初期位置決めから始まり、音響カップリング ゲルの適用に注意してください (BLI/X 線後に適用されます)。同時に、ターゲティングのためのマルチモーダルイメージングを行うことができます。(B)最初は、X線イメージングが可能であるが、一方、関心領域は、脳の輪郭の助けを借りて標的とすることができる(これは次に、頭蓋骨のサイズおよび姿勢に適合したマウス脳アトラス40を参照する)。(c)あるいは、X線最大強度投影上に重ね合わせたルシフェラーゼトランスフェクトびまん性正中神経膠腫腫瘍のBLI画像をターゲティングに適用することができる。(D)続いて、定位プラットフォームは、ハイドロフォンとトランスデューサーの両方を取り付けて、動物を治療位置にして取り付けられます。トランスデューサーは、ボーラス注入後に治療位置で自動的に駆動し、選択した軌道を超音波処理します。このシステムは、上図のように複数のプラットフォームがインターリーブ作業を可能にするハイスループット実験に最適化されています。