子宮内エレクトロポレーションに基づく遺伝子導入:マウス胚の胚性小脳細胞にプラスミドDNAを注入する技術

要約

出典:Feng W. et al.CRISPRを介した脳顆粒細胞の機能喪失解析、In Utero Electroporationベースの遺伝子導入。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、マウス胚の小脳ニューロン細胞にプラスミドDNAを子宮内エレクトロポレーションを使用して送達する方法を示しています。この方法は、正常な脳の発達における遺伝子のin vivo機能や、腫瘍進行中のニューロン細胞の遺伝子発現の変化を理解するのに役立ちます。

プロトコル

1. 子宮内エレクトロポレーションを行う

1. 6〜8週齢のマウスを繁殖させ、子宮内エレクトロポレーション用のツールを準備します。交配雄性ホモ接合体Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFPマウスと雌CD-1マウス。CD-1マウスの妊娠時間を膣栓が検出された日から(E0.5)。胚はE13.5日目にエレクトロポレーションされます。
   1. ホウケイ酸ガラスキャピラリー(内径:0.6〜0.8 mm)をマイクロピペットプーラーで引っ張ります。P = 500、Heat = 560、Pull = 150、Vel = 75、Time = 250 の設定を使用します。キャピラリーチップに黒インクでラベルを貼り、注入中の視認性を高めます。実体顕微鏡で定規と鋭利な針ピンセットを使用して毛細血管テーパーをトリミングし、先端を約6mmの長さでトリミングします。
   2. キャピラリーの統一性を維持して、実験の再現性を維持します。トリム中に片側の斜角エッジを作成します。子宮壁の浸透を容易にし、胚の組織損傷を避けるために、先端はできるだけ鋭利にする必要があります.
      手記：または、マイクログラインダーを使用して35°の角度を調整します。毛細血管は、病原体のない条件下で10cmのシャーレに室温で保存することができます。
   3. 手術器具をオートクレーブします。
   4. sgRNA-プラスミドをpT2K-IRES-Lucと等量ずつ混合し、各プラスミドの最終濃度が1 μg/μL以上になるようにし、プラスミド溶液をファストグリーン(最終濃度0.05%)で着色します。エンドトキシンを含まない蒸留水で1%の高速グリーンストック溶液を調製し、0.22μmフィルターでろ過して溶液から色素粒子を除去します
      手記：pT2K IRES-Lucの同時トランスフェクションはオプションですが、生物発光イメージングを使用して、出生後の生存可能なエレクトロポレーション動物の同定が可能です。手術する妊娠マウスの総数に対して十分な量のプラスミドミックスを調製します。マウスあたり約15〜20μLの混合物を使用します(~12個の胚)。すぐに手術を進めてください。
2. 手術のためのマウスの準備
   1. 妊娠中のCD-1マウスにイソフルランを麻酔します。3〜4 vol-%イソフルラン(酸素流量:1.5 L / min)を入れたボックスで麻酔を誘発し、手術中はノーズコーンを介して2 vol-%で維持します.
      手記：完全な手術は30分以内で完了します。必要に応じて、注入する胚とエレクトロポレーションする胚の数を減らします。手術には滅菌手袋を使用してください。
   2. マウスを仰向けにして加熱パッドに置き、麻酔を調整します。
   3. 鎮痛剤(メタミゾール、800 mg / kg体重、皮下(s.c.)、24時間デポ)を注射します.
      。 手記：Metamizol以外の認可された鎮痛薬を使用できます。.
   4. 手術中の目の乾燥を防ぐために、目の軟膏を塗布します。
   5. 手足をテープで固定し、消毒剤で腹部を消毒します。マウスをガーゼで覆い、手術領域のみを露出させます。70%エタノールを手術部位とガーゼに広げます。
   6. 長さ約2cmの皮膚切開を行い、ストレートの手術ハサミで隙間を優しく広げます。linea albaを見つけ、先端が鈍いティッシュハサミを使用して、腹膜を通してわずかに小さい2番目の切開を行います。
   7. 開いた腹腔を予め温めた滅菌1x PBSで湿らせます。
   8. リング鉗子を使用して腹腔から子宮角を慎重に抽出します。隣接する2つの胚の卵黄嚢の間の隙間だけで子宮壁をつかんで、そっと引っ張ります。切開部を通して胚を引っ張る間、胚に圧力をかけないでください。必要に応じて切開部を拡大し、子宮動脈を通る血流を圧迫しないように、子宮角を腹部に配置するように細心の注意を払います。
      手記：場合によっては、一度に1つの子宮角を抜いて交換してから、2番目の子宮角に進むことをお勧めします。
3. プラスミドDNAの注入とエレクトロポレーション
   1. 調製したガラスキャピラリーで約15 μLの着色プラスミド溶液を吸引します。このプロセス中は気泡を避けてください.
      手記：プラスミド溶液は、その濃度が高い場合、チップを詰まらせやすくなります。注射の直前にDNAを放出して、毛細血管をテストします。
   2. リング鉗子で胚を優しく保持し、首の部分を見つけます.
      手記：胚が注入しにくい位置にある場合は、胚を飛ばして次の胚に進みます。胚の再配置が増えると、胚が損傷を受ける可能性が高くなる可能性があります。
   3. 背側後脳を貫通して、事前に準備したガラス毛細血管の先端を第4脳室にゆっくりと突き刺し、続いて約1μLのプラスミドミックスを注入します。染色したDNAが脳から漏れていないこと、ひし形の構造として見えることを確認します
      手記：オプションとして、2.5倍虫眼鏡を使用して、第4脳室と周囲の血管をよりよく視覚化します。注入直後に電気パルスを送達して、プラスミド溶液が他の心室に拡散するのを防ぎます。
   4. 鉗子のようなプラチナピンセットを使用して、電気方形パルス(5パルス、32 mV、50 ms-on、950 ms-off)を印加します(材料の表を参照)。負極が耳を覆い、正極が子宮壁の上の小脳原基に位置するように、電極を横方向に配置します。E13.5胚の効果的なエレクトロポレーションには、直径5mmの電極プレートを使用します.
      手記：母犬あたりの胚^{の総数の2}/3未満を操作することにより、子犬の生存率を高めます。子宮頸部に近すぎる胚は避けてください。操作すると、分娩中に合併症を引き起こし、同腹児全体を危険にさらす可能性があります。電極が胚の心臓に近すぎると、心停止を引き起こす可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
オートクレーブバンド	キスカー・バイオテック	150262
エレクトロスクエアポレーター	BTXの	ECM830
エンドフリー マキシキット	キアゲン	12362
エタノール	メルク	107017
アイ軟膏(Bepanthen)	バイエル	81552983
ファストグリーン	メルク	104022
フィルター(0.22μm)	メルク	F8148
鉗子ストレート	ファインサイエンスツール	91150から20
ガーゼ(X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)	フィッシャーサイエンティフィック	15387311
フィラメント付きガラスキャピラリー	成茂	GD1-2
ヒーティングパッド	サーモラックス	463265 / -67
イソフルラン	ゾエティス	TU061219
リング鉗子	ファインサイエンスツール	11103-09
実体顕微鏡	ニコン	C-PS
手術用ハサミ	ファインサイエンスツール	91460から11
先端が鈍い手術用ハサミ	ファインサイエンスツール	14072-10
ピンセット、5mmディスク電極付き、プラチナ	エクセルティスGmbH	CUY650P5
メタミゾール	WDTの
非滅菌シルク縫合糸(0.12 mm)	ファインサイエンスツール	18020-50
PBSの(1x)	ライフテクノロジー	14190169
ティッシュハサミ ブラント (11.5cm)	ファインサイエンスツール	14072-10
pCAG-EGxxFP	アドジーン	50716
pX330プラスミド	アドジーン	42230

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