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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 坐骨神経摘出
術
- 以前に坐骨神経にがん細胞を注射したマウスを採取し、CO2で安楽死させます。マウスを腹側に置き、ピンを使用して遠位肢を安定させます。
- 注射した手足と胴体の背側の皮膚を取り除きます。
- 鈍的解剖を使用して、坐骨神経を筋肉の奥深くに露出させます。
- 神経は腸骨と仙骨の間を流れます。脊髄領域の神経にアクセスするには、2つの骨を分離します。まず、坐骨神経が位置する狭い部分に閉じたハサミを挿入し、次にマウスを握ったままハサミを開きます。繊細で、解剖中の坐骨神経の完全性を維持してください。
- 大腿骨の端から遠位、脊髄の近位で坐骨神経を慎重に解剖します.
手記：侵された神経は非常に壊れやすく、緊張や無理矢理な取り扱いで壊れやすいです。
- 最初にその遠位端を切って神経を収穫します。神経を隣接する組織から解放しながら、神経を慎重に持ち上げます。脊柱からの出口にできるだけ近づいて、近位端で神経を切断します。
- その後、バーニアキャリパーを使用して侵入の総長を記録します。この巨視的な推定はあくまでも目安です。
2. 神経の処理と定量化
- 解剖した神経をOCTコンパウンドに埋め込みます。神経を縦方向に、できるだけ型の底に平らに配置するようにしてください。
- カセットに神経の近位側と遠位側を、P(近位)とD(遠位)の文字をマークして示します。
- 埋め込まれた神経をすぐに切片にしない場合は、ドライアイスの上に置きます。サンプルは-80°Cで数週間保存できました。
- 厚さ5 μmのクライオスタットミクロトームを使用してサンプルを切片にし、切片をスライドガラス上に置きます。可能であれば、スライドごとに2つの神経セクションを取り付けます。神経の近位側を示します。
- H&E染色を使用してスライドを染色します。
- 高解像度のデジタルデータを提供するスライドスキャナーを使用して、汚れた神経切片をデジタルスキャンします。
- イメージングソフトウェアを使用して、測定距離ボタン、侵入領域、またはその他の必要なパラメータをクリックして、侵入の長さを定量化します。浸潤の長さを適切に推定するには、同じ神経の複数のセクション(2〜4)を使用します。