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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 腫瘍細胞注射用のマウスの準備
- ケタミン/キシラジンカクテル(ケタミン100 mg / kg、キシラジン10 mg / kg)の腹腔内(i.p.)注射によりマウスを麻酔します。
- 動物の足をつまんで完全な麻酔を確認し、反応がないことを確認します。
- マウスをガラスプレート(タンパク質ゲルの鋳造に使用)に置き、輪ゴムで固定します。
- 必要に応じて、首の毛を剃るか、少量の脱毛剤を塗布してペーパータオルで毛を拭き取ってください
手記：ヌードマウスを使用する場合は、体毛がないため、この手順をスキップしてください。
- ポビドンヨードと70%アルコールを塗布して首の皮膚をきれいにします。
- マウスを解剖顕微鏡のステージに置きます
- 外科用メスで皮膚を~1cmの長さに切開します。
- 歯のある鉗子で筋肉を鈍く解剖して、下の頸動脈を露出させます。
- 頸動脈を隣接する迷走神経から外科的鉗子で分離します。
- 外科用鉗子を使用して、綿球から綿を分離し、湿らせて小さな綿球に成形します。この緩衝液で保湿されたコットンボールを、注射する予定の部位の頸動脈の下に置きます。.
- 綿球の遠位と近位に縫合糸を置き、緩い結び目を作ります。近位結び目を締めて、注射部位への血流を遮断します。
- コットンボールの頸動脈が新鮮な赤い血液で完全に加圧されているように見える場合は、がん細胞注射に進みます。
2. 頸動脈へのがん細胞注入
- ボルテックスし、100μLのがん細胞をシリンジに引き込みます。
- 解剖顕微鏡の下で、31G針(斜めを上にして)を綿球の上に座っている頸動脈の内腔にゆっくりと挿入します。
- シリンジから細胞を頸動脈にゆっくりと注入します。注射の成功は、緩衝されたがん細胞が循環中に押し出されるときに近くの血管や筋肉組織の色が変化することによって顕微鏡下で観察できます。
- 全ボリュームの注入が完了したら、逆流を防ぐために遠位頸動脈を優しく持ち上げます。
- 遠位結び目をすばやく締めて、注入プロセスを完了します。
- 注射が完了したら、結紮糸を締め、解剖顕微鏡下のマイクロハサミで余分な絹縫合糸をトリミングします。分離した筋肉を後退させて、創傷部位を覆います。2つのホッチキスで皮膚を閉じます。
3. 外科的回復
- 操作した動物を回復のために加熱パッドに移します。動物が意識を取り戻すのに30〜60分かかる場合があります。その間、術後鎮痛薬としてブプレノルフィン(0.05 mg / kg)を皮下注射で投与します。.
手記：鎮痛は、地域の IACUC 承認プロトコルに従って提供する必要があります。
- 動物が目覚めて通常の行動に戻ったら、マウスを住居の場所に戻します。手術後数日間、マウスにゲルフードを提供します。手術記録を保持し、部屋に保管してください。
4. 非侵襲的In Vivoイメージング
- ルシフェラーゼレポーターコンストラクトで標識された細胞については、in vivoイメージングシステムを使用してがん細胞注入効率を測定します><。
手記：研究動物への過度のストレスを避けるため、注射当日のイメージングは行いません。