ゼブラフィッシュ胚への腫瘍細胞の長期同所性移植:ゼブラフィッシュ胚の第4脳室に腫瘍細胞を送達する効率的な方法による腫瘍細胞の挙動の長期解析

要約

出典:Casey, M. J. et al.腫瘍細胞の挙動と薬物応答の長期研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫能力宿主への移植。J. Vis. Exp. (2017年度)

このビデオは、免疫担当ゼブラフィッシュ胚の第4脳室へのゼブラフィッシュ脳腫瘍細胞の同所性移植を示しています。この手順により、腫瘍細胞の浸潤と挙動の長期的な研究が可能になります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腫瘍懸濁液を2-dpf胚の第4脳室に注入

する

1. 10〜20個の麻酔解角化胚をトランスファーピペットを使用して注入プレートの周辺に移し、胚は注入プレート上に横方向に落下し、心室がはっきりと見えてアクセス可能になるべきである。角度付きプローブを使用して、必要に応じて胚を調整し、注入プレートの外縁から離して配置します。
2. ゲルローディングピペットチップを使用して腫瘍細胞懸濁液の1〜2μLを注射針にロードし、針をマニピュレーターに挿入します。
3. マニピュレーターを手動で下げ、針を45°の角度で保持します。マイクロマニピュレーターのノブをx、y、z方向に調整し、針が胚の頭のすぐ上、約5mm右に来るようにします。実体顕微鏡の接眼レンズを覗き、針が胚の第4脳室を貫通するまで、マイクロマニピュレーターをx方向にゆっくりと調整します。針が心臓や卵黄を突き刺さないようにしてください。
   1. マイクロインジェクターに取り付けられているフットペダルを押して、腫瘍細胞懸濁液を注入します
      手記：注入圧力と時間は針の穴のサイズによって異なりますが、適切な開始点は5〜10PSIと50〜100ミリ秒です。注入された腫瘍細胞の量は、必要に応じて、鉱物油への注入を通じて標準的なオイルドロップ技術で評価できます。通常、液滴径 0.1 mm で 500 pL の注入が最良の結果をもたらします。
4. 注入した胚を注入プレートからシャーレにやさしく洗い流し、新鮮な卵水(逆浸透水中の0.6 g / L水槽塩+ 0.01 mg / Lメチレンブルー)を使用します。.残りの手順の間、またはそれらがタンクで成長するまで、胚を卵水に保持します。
5. 注入した胚を蛍光実体顕微鏡で観察します。注入圧力、角度、針のサイズ、および細胞懸濁液の粘度により、腫瘍細胞が心室空間の25〜50%を占めることを確認します。必要に応じて、これらのパラメータを調整します。
6. 残りの胚に対して手順1.1〜1.5を繰り返します。必要に応じて、追加の胚に麻酔をかけます。
   手記：経験豊富なユーザーは、3〜4時間で最大300個の胚を注入できます。
7. 胚を28°Cのインキュベーターに一晩戻します。
8. 翌日、説明されているように、正常な心臓や脳の発達などの形態学的および生理学的特徴を調べることにより、胚の生存を評価します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
卵の水	社内		胚の維持、注入プレートの作製
ペトリ皿	サーモフィッシャー	FB0875711Z	胚の収容、注入プレートの作製
ガラス容器	あらゆる商業ブランド		インジェクションプレートの製作
マイクロピペット	あらゆる商業ブランド		腫瘍の再懸濁と移植
アングルプローブ	ファインサイエンスツール	10140-02	胚操作
トランスファーピペット	あらゆる商業ブランド		胚操作
実体顕微鏡	オリンポス	SZ61	腫瘍移植
蛍光実体顕微鏡	オリンポス	SZX16	腫瘍移植のイメージング
顕微鏡カメラ	オリンポス	DP-72	腫瘍移植のイメージング
孵卵器	あらゆる商業ブランド		胚の維持、注入プレートのウォーミングアップ
N2	あらゆる商用ブランド		マイクロインジェクターのセットアップ用
ガラスキャピラリー(フィラメントなし)	世界の精密機器	TW120-4	腫瘍移植
ニードルプーラー	サッターインストゥルメント	P-97	腫瘍移植
マイクロローダーのヒント	エッペンドルフ	930001007	腫瘍移植
マイクロインジェクター	ハーバード大学装置	PLI-90	腫瘍移植
トリカイン-S (MS-222)	ウエスタンケミカル	TRS1	腫瘍移植、麻酔薬
アガロース	デンビル	CA3510-8	インジェクションプレートの製作
マイクロ波	あらゆる商業ブランド		インジェクションプレートの製作
規模	あらゆる商業ブランド		インジェクションプレートの製作
手袋	あらゆる商業ブランド		プロトコルのすべての側面
プロナーゼ	ロシュ・ダイアグノスティック	11459643001	デコリオネート胚
カミソリブレード	サーモフィッシャー	12640	針の準備
50 mLビーカー(直径2インチ)	あらゆる商業ブランド		インジェクションプレートの製作
ガラス容器	あらゆる商業ブランド		インジェクションプレートの製作
メチレンブルー	シグマ・アルドリッチ	M9140	真菌の増殖を防ぐために卵水に加え

の の ス の ます