マウスモデルにおける治療用神経幹細胞(NSC)の鼻腔内送達:腫瘍溶解性ウイルスをロードしたNSCの脳腫瘍担持マウスモデルへの腫瘍標的送達の手順

要約

出典:Yu, D. et al.マウスモデルにおける神経膠芽腫への治療用幹細胞の鼻腔内送達。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、腫瘍溶解性ウイルスをロードした治療用神経幹細胞を脳腫瘍担持マウスモデルに鼻腔内送達する方法を示しています。幹細胞の非侵襲的な鼻腔内投与は、血液脳関門をバイパスし、治療適用のために脳内の腫瘍部位への送達を促進します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ヒトNSCsの低酸素プレコンディショニング(図1A)

1. T75培養フラスコで90%のコンフルエントに達するまで、NSCをプレート培養します。
2. 細胞培養フラスコを、自動内蔵流量計によって制御されるN₂ガス供給を介して、1% O₂レベルを24時間維持した加湿CO₂チャンバー/インキュベーター内に置きます。これらのセルは ^HNSC と呼ばれます。制御 ^NNSC は次のように生成されます。
   1. 加湿された37°Cインキュベーター内の10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM培地で、95%の室内空気と5%_CO2の下でヒトNSC(クローン HB1.F3.CD)を維持します。

2. 腫瘍溶解性ウイルスによるヒトNSCのロード (図1B-1H)

1. ^NNSC、^HNSCに50の条件付き複製アデノウイルス(CRAd)-S-pk7ウイルス粒子/細胞を感染させます。
2. 室温で2時間インキュベートし、定期的にタッピングした後、細胞を培地で3回洗浄して未結合のウイルス粒子を除去し、細胞を滅菌生理食塩水に懸濁して注射します
   注意：BSL2など、適切なバイオセーフティレベル指定を受けた施設で、ウイルス関連のすべてのin vitro細胞培養手順を実施します。腫瘍溶解性ウイルスを取り扱う研究者は、施設の動物施設のガイドラインに従って、適切な個人用保護具を着用する必要があります。

3. 治療用神経幹細胞の鼻腔内送達 (図 1D および 図 2D)

1. NSC(^NNSC、^HNSC)を培養して収集します。
手順に従って
2. 、ケタミンとキシラジンの混合物のi.p.注射を介してマウスを麻酔します。
   1. 承認された試薬を使用して体重に基づいて動物に麻酔をかけます、すなわち、ケタミン (50–100 mg/kg; 承認された用量範囲については施設の IACUC に相談してください) とキシラジン (5–10 mg/kg; 承認された用量範囲については施設の IACUC に相談してください) の混合物の腹腔内 (i.p.) 注射を介して、200–250 μL の滅菌生理食塩水に麻酔をかけます。 または、吸入装置を使用した4〜5%イソフルラン麻酔を介して。
体温を維持するために、マウスを
3. 上向きにして清潔なドレープに置きます。ペーパータオルを丸めてテープで作ったパッド入りの枕を調整して、マウスの頭の下に置いたときに鼻孔の直立角度を確保します。
4. マイクロピペットを使用して、2 μLのNSC懸濁液をマウスの各鼻孔に分注します。次のマウスに移動する前に、液滴の吸引を視覚的に確認します。送達される細胞の総数は、ユーザーが決定することができる。62,500〜125,000細胞/μLを使用し、4 x 2 μLの用量で0.5〜100万個の細胞を送達できます。
5. タイマーを使用して、各細胞懸濁液投与の間隔を5分、最大4回確保します。
6. 動物が回復室で動きを取り戻すのを許し、仰臥位は全体を通して維持されます。

結果

図1:鼻腔内投与前の一般的な幹細胞調製手順のフローチャート。(A-C)CXCR4を過剰発現するための幹細胞の低酸素前処理または遺伝子改変。(B-D)洗浄、酵素解離、細胞収集、および計数ステップは、その後の幹細胞に治療用または診断用カーゴをロードするために行われます。(E)腫瘍溶解性ウイルスなどの治療薬、またはMPIO粒子などの診断トレーサーを、定期的な振とうと穏やかな攪拌により、収集した幹細胞に適切な濃度でロードできます(F)。(G-I)その後、ロードされた幹細胞を洗浄し、マウスへの鼻腔内送達のためにカウントすることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞培養用品(プラスチック)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	異なります	任意のソースと交換可能
Legend Micro 21R 冷蔵マイクロ遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75002490	任意のソースと交換可能
ベンチ遠心分離機 Sorvall ST16R	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75004240	任意のソースと交換可能