微小腫瘍の生成:薬物治療に対する反応を解析するための3D微小腫瘍を培養するIn vitro培養技術

要約

出典:Gilbert, A. N. et al. 3D Human Biogel Culture Systemおよび患者由来の膠芽腫細胞を使用した微小腫瘍の生成。キノミクスプロファイリングおよび薬物応答試験用。J. Vis. Exp.(2016年)

この動画では、3次元ヒトバイオゲルを用いて患者由来の腫瘍細胞から微小腫瘍を作製しています。これらの微小腫瘍は、in vivo腫瘍微小環境によく似ており、薬物試験の潜在的なプラットフォームとして機能します。

プロトコル

1. 微小腫瘍の生成

1. 試薬の調製
   1. 完全なNBMを準備するために、Neurobasal Media(NBM)の500 mLボトル1本に以下を追加して完全なNBMを準備します:ビタミンAを含まない10 mL B-27サプリメント、5 mL N2サプリメント、100 μL EGF、100 μL線維芽細胞成長因子(FGF)-塩基性、5 mLアムホテリシンB、0.5 mLゲンタマイシン、5 mL L-グルタミンを調製し、中和高密度ヒトバイオゲル(HuBiogel)(HDHG、3 mg / mL)を内部プロトコルごとに調製します。同様のバイオゲルマトリックスも使用できます。
2. 微小腫瘍の生産と培養
   1. 解離したばかりのPDX細胞を、氷上で完全なNBM中の単一細胞懸濁液として入手します。
   2. 細胞懸濁液を等量のトリパンブルー溶液(PBSで0.4%)と混合し、血球計算盤を使用して分析し、トリパンブルー排除による細胞数と生存率を決定します。50,000細胞/微小腫瘍(体積=(50,000細胞/腫瘍*#腫瘍)/(生細胞数/ 1mL))を生成するために必要な量を取り出し、新鮮な円錐形のチューブに入れます。
   3. 150 x gで8分間、室温で遠心分離することにより、細胞を濃縮します。上清を捨て、細胞ペレットを氷冷HDHG溶液で、FBSの細胞1部とHDHG細胞4部の最終比率で再懸濁します。
   4. 電動マルチチャンネルピペットを使用して、1ピンあたり10 μLの細胞-HDHG混合物を96ピン鋼板(疎水性コーティング付き)に分注し、微小腫瘍(それぞれ50,000個の細胞を含む2 mmビーズ)を生成します。
   5. 3D腫瘍ビーズを組織培養インキュベーター(37°C、5%CO₂、加湿)内に15分間置き、ビーズをゲル化します。
   6. ゲル化後、微小腫瘍(10 μL)を、電動マルチチャンネルピペットとカスタムピンデバイスを使用して、完全なNBMを含むカスタム懸濁培養チャンバー(50 mL)または大容量培養皿(10 cm)に移します。
   7. 組織培養インキュベーターで1〜2日後、広口分注ピペットを使用して50 μL NBM/ウェルを含む96ウェル培養プレートに微小腫瘍を移し、さまざまなアッセイおよび分析プロトコルを実行します。
3. 微小腫瘍の薬物治療と維持
   1. 薬物検査の最終濃度を選択します.
      注:薬物が2D培養での有効性がわかっている場合は、中用量濃度としてIC50の2倍を選択し、上下の3倍の段階希釈を選択して、合計5つの用量レベルを選択します。例えば、2D培養の薬物のIC50が9μMの場合、薬物試験の最終濃度として2μM、6μM、18μM、54μM、162μMを選択します。
   2. ジメチルスルホキシド(DMSO)ストックから完全なNBMで2倍薬物投与溶液を調製します。投与溶液を1% DMSO培地で希釈し、5回投与、3倍段階希釈を調製します。
   3. アッセイプレートに50 μLを含む微小腫瘍ウェルに50 μLの投与溶液を添加すると、最終DMSO濃度は0.5%になります。 ステップ1.3.1で決定した各薬物用量で、各反復(例:4)について繰り返します。
   4. 37°C、5%CO₂、加湿組織培養インキュベーターで培養物を1〜14日間維持します。上記のように培地と薬液をリフレッシュすることにより、週に2回培養物を給餌します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラゲナーゼ-I	シグマ・アルドリッチ	CO130
ニューロバサル-A	ライフテクノロジー	〒10888-022
N-2サプリメント	ライフテクノロジー	17502-048	1倍の最終濃度
B-27サプリメント(ビタミンAなし	ライフテクノロジー	12587-010	1倍の最終濃度
組換えヒトFGF-塩基性	ライフテクノロジー	PHG0266	最終濃度 10 ng/mL
L-グルタミン	コーニング Cellgro Mediatech	25-005-CIの	2 mM の最終濃度
ゲンタマイシン	ライフテクノロジー	15750-060	最終濃度:50 ng/mL
トリパンブルー	Pierce ThermoScientific (英語)	15250-061
高密度ヒビオゲル	ビボバイオサイエンス	HDHG-5
DMSOの	漁夫	BP231	カルセインAMおよび化合物の溶解用
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水とCa/Mg	コーニング Cellgro Mediatech	20-030-履歴書	MiliQ 超純水で 1 倍に希釈 (固定前洗浄用)
10%中性緩衝ホルマリン	議定書	〒032-060
100mmガラスシャーレ	漁夫	08-748D

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