SB媒介転位を用いた膠芽腫誘導:トランスポゾンを介したSBプラスミドの新生児マウス脳への統合を用いた新規マウスモデル作製技術

要約

出典:Calinescu, A. A. et al. Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、新生児マウスの心室にトランスポゾンDNAを注入して神経膠芽腫(GBM)を効率的に誘発する技術について説明しています。プラスミドを取り込む脳室下領域の細胞は、ヒトGBMの組織病理学的特徴を持つ腫瘍を形質転換、増殖、および生成します。

プロトコル

1. 新生児室内注射

1. 実験の3〜4週間前に、オスとメスのマウス1匹、およびプラスチック製のイグルーを備えたマウス繁殖ケージを設置します。これにより、豊かな環境が提供され、交配プロセスに役立ちます。
2. 妊娠が確認されたら、オスを新しいケージに移します。交配の18日後、配達のために毎日ケージを監視します。生後1日目(P1)に脳室内注射を行います。
3. 注射液の調製.
   注:注入溶液は、プラスミドDNAをトランスフェクション試薬と混合してトランスフェクション用の粒子を作成することによって作成されます。以下は、Sleeping Beautyトランスポゼースとルシフェラーゼをコードするプラスミド(pT2/SB100x-Luc)と2つのトランスポゾンプラスミド(pT/CAGGS-NRASV12とpT/CMV-SV40-LgT)を1:2:2の比率で調製した注射液の例です。すべてのプラスミドの濃度は2μg/μLです。
   1. 4 μg (2 μL) の pT2/SB100x-Luc、8 μg (4 μL) の pT/CAGGS-NRASV12、8 μg (4 μL) の pT/SV40-LgT、10 μL の 10% グルコースを 1 μg /mL の DNA と 5% グルコースの濃度で最終容量 20 μL まで添加して DNA 溶液を調製します。
   2. 2.8 μL の in vivo jet PEI、7.2 μL の滅菌水、10 μL の 10% グルコースを最終濃度 5% グルコースまで添加して、PEI 溶液を調製します。
   3. PEI溶液をDNA溶液に加え、混合してボルテックスし、室温(RT)で20分間放置します。これで、溶液を注入する準備が整いました。RTで1時間後、溶液を氷の上に保ちます。
   4. 12.5°の開先を備えた30Gの皮下注射針を備えた10μLの清潔なシリンジをマイクロポンプに取り付けます(図1#1)。
4. インジェクションシステムが適切に機能していることを確認するには、自動インジェクター(図1#1)を使用して10μLの水をシリンジに引き出し、シリンジを完全に空にします。
5. 新生児定位固定装置期(図1#3)をドライアイスとアルコールのスラリーで2〜8°Cの温度に冷却します。
6. 子犬を濡れた氷の上に2分間置いて麻酔を誘発します。 麻酔は、残りの手順で冷却された定位固定装置フレームで続行されます。フレームの温度を氷点下より2〜8°Cに維持すると、熱傷を防ぐことができます。特別な予防措置として、子犬は濡れた氷の上に置く前にガーゼで包むことができます。
7. シリンジにDNA/PEI溶液を充填します。
8. 子犬をガーゼで覆われた耳のバーの間に頭を置いて、定位固定装置フレームに固定します(図1b)。頭蓋骨の背側が水平で、フレームの表面と平行であり、頭蓋縫合糸がはっきりと見えることを確認してください。70%エタノールで頭部を拭きます。
9. シリンジの針を下げ、定位固定装置フレームのダイヤルを使用して、針がラムダ(頭頂骨と後頭骨の正中線の交点)に触れるまで、脳定位固定装置の座標を調整します(図1b)。
10. 針を持ち上げ、定位固定装置の座標をラムダに対して横方向に0.8 mm、吻側に1.5 mmに調整します(図1b)。
11. 針が皮膚に触れてわずかにくぼむまで針を下げます。座標を測定します。針をさらに1.5mm下げます。針は皮膚と頭蓋骨を突き刺し、皮質を通過して側脳室に入ります(図1c)。
12. 自動インジェクターを使用して、0.75 μL の DNA/PEI 溶液を 0.5 μL/分の速度で注入します。
13. 子犬をさらにフレームに置き、溶液が心室に分散するのを待ちます。その間に、次の注射に備えて、別の子犬を氷の上で2分間麻酔します。
14. 針をそっとゆっくりと持ち上げ、子犬を暖房ランプの下に置きます。呼吸と活動を監視します。必要に応じて、最初の呼吸が始まるまで手足を優しく刺激します。
15. 子犬が温まり、バラ色に達し、定期的に呼吸し、活動的になった後、通常は5〜7分間、子犬を母親に戻します。一度に複数の子犬を注射する場合は、すべての注射が完了するまですべての子犬を一緒に飼ってください。注射に30分以上かかる場合は、最初の30分後に子犬の半分を戻し、残りの子犬は手順の終了時に戻します。
16. ダムが彼女の子犬に反応し、育てていることを監視します。必要に応じて、代理母をケージに追加します。
17. 子犬を氷の上に置いてからウォーミングランプの下に置く間隔が10分未満であることを確認してください。手順が早ければ早いほど、生存率は高くなります。通常、子犬に麻酔をかけて注射するのにかかる時間は4分です。

結果

図1:新生児マウスにおける脳室内注射の実験セットアップとガイド。(ア)マイクロメータダイヤル付きの定位固定装置フレーム(2)には、10μlのシリンジ(4)を保持する自動インジェクターが取り付けられています。Uフレームの内側には、新生児用アダプターフレームがしっかりと固定されています(3)。(b) 側脳室への注射に必要な座標 (腹側 1.5 mm、ラムダ側 0.8 mm) に針が挿入された新生児マウス (P1) の写真 (c) 新生児マウス (P1) の脳を通る冠状切片の図で、ラムダの相対的な寸法と位置を強調しています。心室。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Stoeltingのラボスタンダードとラット&マウスアダプター	ストールティング	51670	他の会社も同様のフレームを製造していますが、小さなマウスアダプターを備えたものが適しています
五等式脳定位固定装置インジェクター(QSI)	ストールティング	53311	インジェクションはそれなしで行うことができますが、自動インジェクターは再現性と利便性を高めることができます
10 μL 700 シリーズ手動取り付けマイクロリットルシリンジ	ハミルトン	モデル701	このシリンジモデルは、0.5〜500μLの溶液を確実に供給します。他のシリンジ(例えば、5μL、モデル75)も使用することができます
30ゲージ皮下注射針(1.25インチ、15 ^ {o}ベベル)	ハミルトン	S/O# 197462	この針は、他の侵襲的な手順を必要とせずに、新生児マウスの皮膚と頭蓋骨を突き刺すのに理想的です。くすみがついてしまった(皮膚に入りにくい)場合は、交換が必要です。
生体内ジェット PEI	Polyplusトランスフェクション	201-10G	少量で分注し、-20°Cに保ちます
D-ルシフェリン、カリウム塩	Goldbio.com	ラックK-1g	ホタルルシフィファラーゼの他の供給源も同様に十分です
ヘマトキシリン溶液、ハリス修正	シグマ・アルドリッチ	HHS128-4L