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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 解剖
>注:容器が細胞培養目的で使用される場合を除き、無菌状態は必要ありません。単離容器溶液を調製します:B1、1.5 mLのHEPES 1Mを150 mLのHBSSに加えます。B2、20mLのB1に3.6gのデキストランを添加する。B3、B100mLにBSA1gを添加します。
- 150mLのビーカーと20mLのB1を準備します。氷の上に置き、空気汚染を避けるためにパラフィルムで覆います。
- ケージに加えた純粋なイソフルラン1mLに浸した小さなペーパータオルを使用して、フードの下でマウスに深く麻酔をかけます。麻酔は、つま先をつまむことに対する反応の欠如によって検証されます。頸部脱臼でマウスを殺す.
手記：これらの手順は、国内および機関の規制に準拠して達成されます。
- オプション:20 mLのPBS 1xを使用して心臓内灌流を行い、血液含有量を排除します。
- 首から鼻までメスで皮膚を切開し、引き離します。PBS 1xですべての汚染された毛を取り除きます。
- 頭蓋骨を開くには、まず嗅球の前方にハサミを挿入し、ハサミを開いて頭蓋骨を2つに破裂させます。
- 脳ヘラを使用して脳を慎重に取り除きます。脈絡叢を側脳室から解剖すると、血管の準備が汚染されるためです。
手記：オプション: 最終調製物には、実質血管と髄膜血管が含まれます。望ましくない場合は、髄膜を剥がすことができます。
- 氷上のB1溶液が入ったビーカーに脳を移します。最大8つの脳を一緒に治療できます。
2. 脳組織の均質化
- 2つのメスを使用して、B1溶液で脳を手動かつ激しく叩き、その後約2mmの小片を得ました。
- 自動化されたDounceホモジナイザーで調製物を均質化し、400rpmで20ストロークを実行します。エアポケットの形成を防ぐために、ガラス管が氷に保たれていること、および上下に移動するときにダウンサーの上部が溶液中にあることを確認してください。複数のサンプルを調製する場合は、各均質化の間にイオン化水でダウンサーを洗浄します。
3. 容器の浄化
- ホモジネートを50 mLのプラスチックチューブに移し、2,000 x gで4°Cで10分間遠心分離に進みます。大きな白い界面(主にミエリン)が血管ペレットの上部に形成されます(灌流が行われなかった場合は赤)。
- 上清を捨てます。容器のペレットと白い界面は一緒に取り付けられたままになります。氷冷したB2溶液20mLを加え、チューブを手動で激しく1分間振とうします。
- 2回目の遠心分離に進み、4,400 x gで4°Cで15分間。ミエリンは、上清の表面に密集した白い層を形成します。
- チューブを保持し、ゆっくりと回転させて上清が壁に沿って通過できるようにして、ミエリン層をチューブ壁から慎重に剥がします。ミエリンを上清と一緒に捨てます。容器を含むペレットは、チューブの底に取り付けられたままです。
- チューブの内壁を5mLのプラスチックピペットに巻き付けた吸収紙で拭き取り、容器のペレットに触れないように、残留液体をすべて取り除きます。チューブを吸収紙の上で逆さまにして、残っている液体を排出します。
- 低結合チップでピペッティングを上下に行い、チューブを氷上に保持して、ペレットを氷冷したB3溶液1 mLに懸濁し、さらに5 mLのB3溶液を加えます。血管ができるだけ分散し、凝集体を形成しないようにしてください。
4. ろ過
- 氷冷したB3溶液30mLを入れた氷上にビーカーを準備します。空気汚染を避けるためにパラフィルムで覆います。
- ベッカーフラスコの上部にある改造されたフィルターホルダーに20 μmメッシュのフィルターを置き、10 mLの氷冷B3溶液を適用して平衡化します。
- 容器調製物をフィルターに注ぎ、40 mLの氷冷B3溶液で容器をすすぎます。
- きれいな鉗子を使用してフィルターを回収し、すぐにB3溶液が入ったビーカーに浸します。容器をフィルターから取り外します 軽く振ってフィルター。
- ビーカーの内容物を50mLのプラスチックチューブに注ぎ、2,000 x gで4°Cで5分間遠心分離します
手記：あるいは、ステップ3.6からの脳血管の懸濁液を100μmメッシュのフィルターでろ過することもできます。この場合、大きな容器は優先的にフィルターに保持され、フロースルーには微小血管(主に毛細血管)が含まれ、上記のように20μmメッシュのフィルターでろ過されます。
- 1 mLの氷冷B3溶液に微小血管のペレットを再懸濁し、1.5 mLのEppendorfチューブにピペッティングして移します。2,000 x gで4°Cで5分間遠心分離します。