In Vitro食作用アッセイ:リアルタイムのアストロサイト媒介性シナプトソーム食作用を研究するためのライブイメージングベースの方法

要約

出典: Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (2018年)

この動画では、精製したアストロサイトの食作用能力をin vitroでライブイメージングアッセイにより評価しています。このアッセイは、アストロサイトの食作用能力を増強または阻害する可能性のある化合物を同定するための効果的なスクリーニングプラットフォームとして機能します。

プロトコル

1. 食作用ライブイメージングアッセイ(図1)

1. アストロサイトがコンフルエントな24ウェルプレート(またはライブイメージング用に調製された任意のプレート/ディッシュ)を調製します(通常、精製後7〜10日間のインキュベーションが細胞の安定化に理想的です)。
2. 各ウェルの培地を取り出し、1 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)でウェルを3回洗浄します。空気への曝露を最小限に抑えるために、ウェルをすばやく洗ってください。
3. 300 μL のイムノパン処理アストロサイト塩基性培地 (IP-ABM) に 5 μL の pH 指示薬標識シナプトソームと、グリア細胞の食作用を調節できるイムノパン処理アストロサイト馴化培地 (IP-ACM) などの追加因子を添加します。
4. プレートを_CO2インキュベーターで40分間インキュベートします。このステップにより、pH指示薬を標識したシナプトソームがプレートの底部に沈殿します。
5. 未結合のpH指示薬標識シナプトソームを含む培地を取り出し、各ウェルを1 mLのDPBSで3回洗浄します
   注意：激しく洗わないでください。空気への曝露を最小限に抑えるために、ウェルをすばやく洗ってください。
6. 500 μL の IP-ABM と追加のファクターを加えてウェルに試験します。
7. プレートをライブイメージング装置に持って行き、位置を選択します。フォーカス、露光時間、明るさ、LED電源を調整します.
   手記：露光時間、輝度、LED出力の設定は、蛍光強度と実験の目的によって異なります。pH指示薬標識シナプトソームを用いたライブイメージングアッセイでは、通常、これらの値を次のように設定します:露光:~150-200 ms、輝度:15、LED電力:4-6。
8. ライブイメージングの画像形式、時間間隔、および合計サイクル数を設定します。時間間隔を 1 時間または 2 時間に設定します。これは、選択したポジションの数によって異なります。ライブイメージング用に150を超えるポジションを選択する場合は、2時間間隔をお勧めします。
9. ライブイメージング実験を開始します。

結果

図 1.食作用ライブイメージングアッセイの概略図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pHrodoレッド、スクシンイミジルエステル	Moleculaプローブ	P36600	pH指示薬の抱合用
ウシ胎児血清(FBS)	ギブコ	16000-044
DMEM	ギブコ	11960-044
dPBSの	ウェルジーン	LB001-02
食作用ライブイメージングアッセイ
ジュリステージ	ナノエンテック
Time Series Analyzer V3 プラグイン	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html