ニワトリ胚小脳スライスのex vivoエレクトロポレーション:顆粒細胞発生を可視化するための緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNAを導入する方法

要約

出典:Hanzel, M. et al. ニワトリ小脳スライスの生体内培養と顆粒細胞前駆体の空間的に標的化されたエレクトロポレーション。J. Vis. Exp. (2015年度)

この動画では、レポーター遺伝子プラスミドを用いてニワトリ胚小脳スライスのエレクトロポレーションを行っています。この技術により、顆粒細胞前駆体の形成と顆粒層への移動の可視化が容易になります。

プロトコル

1. スライスのエレクトロポレーション

1. エレクトロポレーターのアノードを60mmのシャーレの基部に絶縁テープで固定することにより、エレクトロポレーションチャンバーを構築します。電極を覆うようにHBSSを約1mL加えます。
2. HBSSで覆われた電極の上に0.4μmの培養インサートを置きます。培養インサートを電極に載せて、インサートと電極との間に常に接触があることを確認します.
   手記：このセットアップでは、スライスを含む培養インサートは溶液の表面に載り、回路を維持しますが、カソードの空間的ターゲティングを可能にします。
3. 同定したスライス(培養インサートあたり最大5つ)を、カットチップ付きの3 mLパスツールピペットを使用して培養インサートに移します。分離し、矢状向きの培養インサートに落ち着かせます。
4. ピペットを使用して、スライスが溶液に浸らないように、余分なHBSSを取り除きます。
5. P10ピペットチップを使用して、ピペットDNA(濃度1 μg/μL)をスライスの標的領域の表面に20%のファストグリーンで希釈します。20%のファストグリーンは、粘性のあるDNA溶液を確保し、DNAの法外な広範囲にわたる拡散を防ぎます。各スライスに約5 μL DNA/fast green溶液を加えます(図1B)。
6. カソードを目的の標的組織の上に置き、3 x 10 V、10 msecのパルスでエレクトロポレートします。カソードと組織との直接接触を避けてください。代わりに、液体の表面張力を利用してコンダクタンスを維持します(カソードを実際に組織に触れずに、できるだけ組織の近くに配置してください)。
7. 必要に応じて、個々の小脳切片上のEGLの複数の領域へのDNA導入とエレクトロポレーションを繰り返します。
8. エレクトロポレーションが完了したら、培養インサートを30mmのシャーレに移します。
9. 各培養物に、1 mLの予め加温した培地(Basal Medium Eagle、0.5%(w / v)D-(+)-グルコース、1% B27サプリメント、2 mM L-グルタミン、100 U / mLペニシリン、100 μg / mLストレプトマイシン)を培養インサートの下に加え、培養インサートが培地と接触しますが、スライスは浸されません。
10. 培養物を37°C/6%CO₂で最大3日間インキュベートします。24時間ごとにすべての培地を、事前に温めた新鮮な培地と交換します。
11. 培養後、スライスを培養インサートに1時間、培養液を含まない新鮮な30 mmディッシュで4%パラホルムアルデヒド(または4°CでO / N)で固定します。

結果

図1.設置されたエレクトロポレーションチャンバー (A)カスタムメイドのエレクトロポレーションチャンバーの写真。チャンバーは、60mmのペトリ皿のベースにしっかりと配置されたエレクトロポレーターのアノードで構成されています。ディッシュには、電極を覆うために約1mLのHBSSが含まれています。培養インサートは、インサートと電極との間に一定の接触で電極上に置かれ、回路を維持しながら、手で操作されるカソードの空間的ターゲティングを可能にする必要があります。(B)スライスがエレクトロポレーションされている写真。スライスはDNA/fast green溶液で覆われています。スライスは必要に応じてエレクトロポレーションされます:エレクトロポレーションは、1つのフォリウムまたは複数の場所をターゲットにすることが...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ベイサルミディアムイーグル(Gibco)	ライフテクノロジー	41010-026
L-グルタミン	シグマ	G7513
ペニシリン/ストレプトマイシン	シグマ	P4333
0.4 μm 培養インサート	ミリポア	PICM0RG50
TSS20 オボダインエレクトロポレーター	イントレーセル	01-916-02	エレクトロポレーションには3 x 10 V 10 msecパルスを使用します。