小脳解剖とスライス調製:マウス小脳から組織スライスを生成する方法

要約

出典:Thetiot, M. et al.骨髄器官型小脳スライス培養物の調製と免疫染色。J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、マウスの小脳から組織切片を生成する方法を説明しています。小脳切片は、器官型培養に使用でき、髄鞘形成ダイナミクスを含む神経発達メカニズムに関する洞察を得ることができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 小脳の解剖と切片の準備 (実習時間 ≈ 1動物あたり15–20分)

1. 氷冷解剖培地が入った60 mm細胞培養皿の1つを双眼顕微鏡の下に置き、トッププレートを取り外します。
2. 70%エタノールで頭の毛皮を綿棒で拭き(動物の目に触れないように注意して)、承認された手順に従って、大きな鋭利なハサミを使用して動物の首を切ります
   注:小脳切片は、特定の性別または系統バイアスなしにP9-P10マウスから生成されます。
3. 小さなハサミを使用して、首からマウスの銃口まで、頭の正中線に沿って皮膚を切ります。
4. 頭を抱えて頭蓋骨を露出させるには、皮膚を頭の下で腹側に折り返し、2つの皮膚のひだを指でつまみます。
5. 小さなハサミを大孔にそっと挿入し、横方向に1つずつ切開して頭蓋骨を切断し、頭蓋骨の周り全体を切断します。脳組織の損傷を避けるために、切断するときははさみの先端をできるだけ平行にして頭蓋骨に近づけてください。
6. 頭蓋骨の背側部分を細いまっすぐな鉗子を使用して回収します。頭蓋骨の背側部分を慎重に持ち上げながら、必要に応じて付着している髄膜(脳組織を囲む半透明の灌漑膜)を小さなハサミで切断し、脳組織を傷つけないようにします。
7. 腹側頭蓋骨と脳の間に細いまっすぐな鉗子を慎重に導入し(またはヘラを使用)、脳をそっと反転させ、小さなハサミで視神経と三叉神経を切断します。
8. 氷冷解剖培地が入った60mmの細胞培養皿に脳が重力で落下するのを助けます。皿のすぐ上で頭を逆さまにして、必要に応じて小さなハサミで最後の癒着を放出します。
9. 細い鉗子を使用して、背側を研究者に向け、腹側を皿の底に横たわるように脳を向けます。
10. 双眼顕微鏡では、細いまっすぐな鉗子を使用して前脳側の脳を固定し、損傷を受ける可能性があるため、後脳に触れないようにします。細くまっすぐな鉗子を使用して、後脳を脳の残りの部分(前脳と中脳、図1Aaの概略図を参照)から分離します。小脳を後脳の残りの部分から分離するには、細い鉗子を使用して小脳の下の小脳脚を切断します(図1Aa'の概略図を参照)。
11. 小脳が分離されたら、細いまっすぐな鉗子を使用して髄膜を慎重に引き裂きます(図1Aa 'の概略図を参照)。
12. 細く湾曲した鉗子で小脳をそっと保持し、背側を上にして、チョッパーカミソリの刃に対して垂直にプラスチックプラットフォームに置きます(図1Bbの概略図を参照)。
13. 1 mLピペットに適合した滅菌済みの細い端のピペットチップを使用して、小脳周囲の過剰な解剖培地を吸引します(図1Bbの概略図を参照)。
14. セクショニング中に最適な矢状スライスを得るために、プラットフォームに配置されたら、小脳が平らになるが、引き伸ばされていないことを確認してください(図1Bbの概略図を参照)。
15. ティッシュチョッパーで小脳の厚さ300μmの矢状切片をスライスします(図1Bb'の概略図を参照)。ブレードの力と速度は、現場で最適化する必要があります。
16. スライスした小脳に解剖用培地をそっと一滴加えます。1 mLピペットに幅広のピペットチップを取り付け、スライスした小脳をゆっくりと吸引し、氷冷解剖培地を含む60 mm細胞培養皿に戻します(図1Bbの概略図を参照)。
17. ティッシュチョッパーのプラスチックプラットフォームを、各小脳スライスの間に100%エタノールで清掃します。エタノールを蒸発させてから、次の小脳をプラットフォームに置きます。
18. 2つの細いまっすぐな鉗子(または別の方法:チタン針)を使用して個々のスライスを分離し、バーミから6〜8スライスを選択します(図1Ccおよび1Cc 'の概略図を参照)。
19. 培養インサート付きの6ウェルプレートを用意し、1 mLピペットに適合したワイドボアピペットチップを使用して、選択した最大4つのスライスを1つの培養インサートと解剖培地に移します(図1Cc'の概略図を参照)。
20. 解剖用培地または鉗子を使用して、スライスを培養インサートの中央に置き、互いに接触しないように、スライスを適切な位置に優しく押したり引いたりします(図1Cc'の概略図を参照)。
21. 細いピペットチップを使用して、スライスの周りの余分な解剖媒体を取り除きます。スライスがメンブレン上に平らに置かれていることを確認します(図1Cc'の概略図を参照)。
22. メンブレンにスライスを追加した直後に、6ウェルプレートをインキュベーターに入れます。

結果

図1:小脳スライスの生成の図。解剖は、大きく分けて3つのステップに分かれています。(A)小脳を分離し、髄膜を切除します(ステップ1.10および1.11)。(B)次に、小脳をチョッパープラットフォームに移し、スライスします(ステップ1.12〜1.16)。(C)最後に、スライスをバーミから分離し、メンブレンインサート上に配置します。スライスとともに移された解剖培地を取り出し、6ウェルプレートをインキュベーターに入れます(ステップ1.18および1.22)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BMEミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	41010026
ハンクの平衡塩溶液(10x HBSS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14180046
GlutaMAX (100倍)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050038
ヒートインアクティベートホースセラム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	26050088
ペニシリン-ストレプトマイシン(10.000 IU / mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122
Gey's Balanced Salt Solution(ゲイのバランスの取れたソルトソリューション)	シグマ・アルドリッチ	G9779-500ミリリットル
D-グルコース溶液(45%)	シグマ・アルドリッチ	G8769-100ミリリットル
パラホルムアルデヒド(PFA)	電子顕微鏡科学	15714
無水エタノール(100%エタノール)	VWRケミカルズ	20821年33
トリトン® X-100	シグマ・アルドリッチ	100〜500ML	-20°Cで冷却
10%ノーマルヤギセラム(NGS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	500622
リン酸緩衝液	ユーロメデックス	ET330-Aの
ティッシュチョッパー	マキルウェイン		pH 7.4
カミソリの刃
大きなはさみ	F.S.T(エフエスティー)	14101-14
小さなハサミ	F.S.T(エフエスティー)	91500から09
細直鉗子	F.S.T(エフエスティー)	91150から20
湾曲細鉗子	F.S.T(エフエスティー)	11297から00
細胞培養ディッシュ(60 mmおよび100 mm)	TPPとは
4ウェル、6ウェル培養プレート	TPPとは
ミリセル培養インサート(0.4 μm、直径30 mm)	メルクミリポア	PICM0RG50
細胞培養インキュベーター
ファインエンドピペットチップ	ダッチャー	134000CL	37°C、5%CO2
ワイドボアピペットチップ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	2079グラム
滅菌シリンジ	テルモヨーロッパ
滅菌シリンジフィルター	テルモヨーロッパ		20または50 mL
メス	スワン・モートン	510	0.22μm
ブラシ
顕微鏡スライド	RS フランス
ガラスカバースリップ	RS フランス		76 mm x 26 mm x 1.1 mm
Kimtech Sciences社製ティッシュワイパー	キンバリー・クラーク・プロフェッショナル	5511	22 mm x 22 mm
双眼顕微鏡