器官型脳スライス培養におけるシングルセルエレクトロポレーション:脳海馬スライスの標的ニューロン内にプラスミドを送達するためのIn vitro技術

要約

出典: Keener, D. G. et al. マウス海馬興奮性およびクラス特異的抑制性ニューロンの異なる器官型スライス培養におけるシングルセルエレクトロポレーション。 (2020年)

このビデオは、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンの両方で、さまざまなin vitro海馬スライス培養における遺伝子の単一細胞エレクトロポレーションのプロトコールを示しています。この手法は、細胞の自律メカニズムやシナプス間タンパク質相互作用など、ニューロンの特定の分子的および生理学的機能を調べるのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. スライス培養の準備

1. 出生後6〜7日齢の雌雄マウスを使用して、マウス器官型海馬スライス培養物を調製します。
   (
   1. mM)からなる有機型スライス培養用の解剖培地を調製します:238スクロース、2.5 KCl、1 CaCl₂、4 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄、および11グルコースを脱イオン水に浸し、次に5%CO₂ / 95%O₂をpH7.4のガス
   で溶かします。
   2. 78.8% (v/v) Minimum Essential Medium Eagle、20% (v/v) ウマ血清、17.9 mM NaHCO₃、26.6 mM グルコース、2 M CaCl₂、2 M MgSO₄、30 mM HEPES、インスリン (1 μg/mL)、および 0.06 mM アスコルビン酸 (pH 7.3) からなる器官型スライス培養培地を調製します。浸透圧計を使用して、浸透圧を310〜330 osmolに調整します。
   3. 2本のヘラを使用して全脳から海馬を解剖し、ティッシュチョッパーを使用して(400μm)スライスします。2つの鉗子を使用してスライスを分離し、インサートの下に培地(950 μL)を充填した6ウェルプレート内の30 mm細胞培養インサートに移します。
2. 器官型スライス培養物を組織培養インキュベーター(35°C、5% CO₂)で保存し、スライス培養培地を2日ごとに交換します。

2. プラスミドの調製

1. 目的遺伝子のプラスミドを調製します。
   1. サブクローン増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子をpCAGベクターに。
   2. エンドトキシンフリー精製キットでpCAG-EGFPプラスミドを精製し、140 mM K-メタンスルホン酸、0.2 mM EGTA、2 mM MgCl₂、および10 mM HEPESを含むジエチルピロカーボネート処理水からなる内部溶液に溶解し、KOH(プラスミド濃度:0.1 μg/μL)でpH 7.3に調整します。

3. ガラスピペットの準備

1. マイクロピペットプーラー(図1A)でホウケイ酸ガラスピペット(4.5〜8MΩ)を引きます(図1A).
   手記：全細胞パッチクランプ記録に使用されるガラスピペットは、エレクトロポレーションに最適です。
2. ガラスピペットを200°Cで一晩焼き、滅菌します。
3. 解剖顕微鏡でピペットチップのサイズを確認し、電気抵抗を概算します。
   1. オプション:ピペットをエレクトロポレーション電極に取り付けてピペット抵抗を確認し、マイクロマニピュレーターを使用してピペットチップをフィルター滅菌人工脳脊髄液(aCSF)に操作します（mM:119 NaCl、2.5 KCl、0.5 CaCl₂、5 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄および11グルコースを脱イオン水中、5%CO₂ / 95%_O2でガス化pH 7.4 まで。エレクトロポレーターの読み出しを使用して実際の抵抗を確認します.
      手記：ピペットの先端が鋭いほど、電気抵抗は大きくなります。ピペット抵抗は10MΩ未満である必要があります。ピペット抵抗が高いガラスピペット(図1B)は、エレクトロポレーションを繰り返すと先端が詰まることがよくあります。

4. エレクトロポレーションリグのセットアップ

1. エレクトロポレーターを標準的な全細胞電気生理学装置に取り付け、マイクロマニピュレーターと蠕動ポンプを備えたシフトテーブルに取り付けられた直立顕微鏡
を装備した装置に取り付けます。
2. エレクトロポレーターのヘッドステージをマイクロマニピュレーターに取り付け、エレクトロポレーターにスピーカーを接続します。エレクトロポレーターをフットペダルに接続し、準備ができたらパルスを送信するために使用できます.
   手記：スピーカーは、電源を入れると、電極の電気抵抗を示すトーンを発します。これにより、手順から注意をそらすことなく、抵抗の相対的な変化を決定することが可能になります。

5. エレクトロポレーションの準備

1. スライス培養インサートを6ウェルプレートから900 μLの培養培地を充填した3 cmシャーレに移し、エレクトロポレーションを行う準備ができるまで卓上型_CO2インキュベーターに保存します。
   1. エレクトロポレーション後に、スライス培養培地(1 mL)を3.5 cmのシャーレで少なくとも30分間、新鮮培養インサートをプレインキュベートします。
2. リグを清掃し、エレクトロポレーションの準備をします。
   1. 10%漂白剤でラインを5分間灌流し、その日の実験を開始する前にチューブとチャンバーを滅菌します。
   2. 脱イオンオートクレーブ水でラインを少なくとも30分間灌流し、完全にすすぎます。
   3. 0.001 mM テトロドトキシン (TTX) を含むフィルター滅菌 aCSF でラインを灌流します.
      手記：TTXは、介在ニューロンの過剰興奮による細胞毒性と死を最小限に抑えます。
3. エレクトロポレーターのパルス・パラメータを設定します。振幅は -5 V、方形パルス、列は 500 ms、周波数は 50 Hz、パルス幅は 500 μs です。
4. ガラスピペットに5 μLのプラスミド含有内部溶液を入れます。
   1. ピペットチップに溜まった気泡を取り除くには、チップを複数回フリックして軽くたたいます。
   2. チップを解剖顕微鏡で視覚化するか、手順3.3.1を繰り返してピペットの抵抗を確認して、チップに損傷がないか確認します。
      手記：チップが損傷している場合は、ガラスピペットを廃棄し、ステップ3で以前に準備した新しいガラスピペットでこの手順を繰り返す必要があります。
5. ピペットチップを電極にしっかりと取り付け、スピーカーをオンにします。チップがaCSF媒体と接触したときのエレクトロポレーターの読み出し(ピペットの抵抗)を記録します。
6. 鋭利な刃を使用して培養インサートメンブレンを切断し、1つのスライス培養物を分離します。鋭角の鉗子を使用してスライス培養物をエレクトロポレーションチャンバーに慎重に移し、スライスアンカーでその位置を固定します。
   1. ニューロンの健康や機能の変化などの副作用を防ぐために、スライス培養物を一度に30分以上インキュベーターの外に置いたままにしないでください。

6. 目的の細胞をエレクトロポレートする

1. 口で、またはチューブに取り付けられた1mLシリンジ(0.2〜0.5mLの圧力)を使用して、ピペットに陽圧を加えます。
2. マイクロマニピュレーターの3次元ノブコントロールを使用して、スライス培養物の表面近くでピペットチップを操作します。
3. 標的細胞を選択し、顕微鏡で見える細胞表面にくぼみが形成されるまで陽圧をかけたまま、それに近づきます。
4. 圧力サイクルを実行します。
   1. ピペットチップと原形質膜との間に緩いシールが形成されるように、口から軽度の負圧をすばやく加えます。これは、メンブレンがピペットチップにいくらか上がることで視覚的に示されます。スピーカーからのトーンの増加を聞いて、ピペット抵抗の増加(初期抵抗の~2.5倍)を観察します。ディンプルが再形成されるように、すぐに陽圧を再適用します。
   2. 一時停止せずに少なくともさらに2回の圧力サイクルをすぐに完了し、負圧を1秒間保持します
      手記：サイクル間で一時停止したり、圧力をかけすぎたり、負圧を長時間保持したりすると、セルに重大な損傷を与え、エレクトロポレーション中にセルが死滅する可能性があります。
5. スピーカーからのトーンがピッチの安定した頂点に達したら、フットペダルを使用してエレクトロポレーターをすばやくパルスし、ピーク電気抵抗を示します。パルスを送信する前に、ピーク抵抗で1秒以上待たないでください.
   手記：このプロトコルを使用した場合、オフターゲットエレクトロポレーションは観察されていません。圧力サイクル中にガラスピペットと接触した細胞のみをトランスフェクションしました。ピペットを他のニューロンの近くに配置しても、遺伝子導入は行われません。
6. 圧力をかけずに、ピペットを細胞から約100μmゆっくりと引っ込めます。
7. 正圧を再度印加し、抵抗がステップ5.5で記録された読み出しと同様であることを確認してから、次のセルに近づきます。
   1. エレクトロポレーション後に視覚的に、またはピペット抵抗が大幅に増加(>15%高い)によって示される潜在的な詰まりを、正圧を適用することにより除去します。
      手記：目に見える詰まりがなく、抵抗がまだ大幅に高い場合は、ピペットを廃棄して新しいピペットを使用してください。ユーザーが注意すれば、平均してピペットは最大20回のエレクトロポレーションイベントに使用できます。

エレクトロポレーション後、スライス培養物を新鮮な培養インサートに移し、インキュベーター内で35°Cで最大3日間インキュベー

トします。

結果

図1:2つの代表的なガラスピペット画像。(A)このプロトコルで使用される低抵抗(6.5MΩ)ピペット、および(B)エレクトロポレーションプロトコルに典型的な高抵抗(10.4MΩ)ピペットを表示します。

図2:器官型の海馬スライス培養物を、3つの異なる時点でEGFP(緑)でエレクトロポレーションしました。(A)DIV7 Pv/TdTomatoマウスにおける代表的な器官型海馬スライス培養。CA1錐体ニュ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プラスミド調製
プラスミド精製キット	キアゲン	12362
器官型スライス培養調製
6ウェルプレート	グライナーバイオワン	657160
デュモン #5/45 鉗子	FSTの	#5月45日	器官型スライス培養調製のための角度付き解剖鉗子
フラスコフィルターユニット	ミリポア	SCHVU02RE	培地のろ過と保存
孵卵器	バインダー	BD C150-UL
マキルウェインティッシュチョッパー	テッド・ペラ(株)	10180	器官型スライス培養調製用の組織チョッパー
ミリセル細胞培養インサート、30 mm	ミリポア	PIHP03050	器官型スライス培養インサート
浸透圧計	プレシジョンシステム	オスメットII
PTFEコーティングされたヘラ	コール・パーマー	SK-06369から11
鋏	FSTの	14958から09
実体顕微鏡	オリンポス	SZ61
滅菌真空ろ過システム	ミリポア	SCGPT01RE	aCSFのろ過と保管
電極調製
キャピラリーグラス	ワーナー・インストゥルメンツ	640796
マイクロピペッタープーラー	サッターインストゥルメント	P-1000	引き手
オーブン	バインダー	BD(E2)
プーラーフィラメント	サッターインストゥルメント	FB330Bの	引き手
3.5mmファルコンシャーレ	BDファルコン	353001
エアテーブル	TMCの	63-7512E
CCDカメラ	Qイメージング	レティガ-2000DC	カメラ
エレクトロポレーションシステム	分子デバイス	アクソポレーター800A	エレクトロポレーター
蛍光照明システム	事前	ルーメン 200
マニピュレータ	サッターインストゥルメント	MPC-385	マニピュレータ
メタモルフソフトウェア	分子デバイス		画像取得
蠕動ポンプ	レイニン	ダイナマックス、RP-2	灌流ポンプ
シフトテーブル	ルイグス&ノイマン	240 XYの
話者	不明		エレクトロポレーターに接続されたスピーカー
実体顕微鏡	オリンポス	SZ30
テーブルトップインキュベーター	サーモサイエンティフィック	MIDIの40
正立顕微鏡	オリンポス	BX61WI

の シリーズ