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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 脊髄の採取
>注:無菌性のために、すべての機器はオートクレーブ処理(135°Cおよび30psi、4 x 7分サイクル)する必要があります。
- 生後1〜3日のC57BL / 6マウスの子犬をイソフルランの入ったチャンバーで安楽死させます。動きが止まってから30秒待ってから、脚をつまんで反応がないことを確認します。
- はさみを使用して頭を体から分離し、子犬を腹臥位にします。
- 背側がユーザーに向けて、処置台の上で後ろ足または尾と腕を安定させます。
- 湾曲した虹彩はさみを使用して皮膚を切り取ります。
- 腰のすぐ上の腰部から脊髄を切断し、胸部の両側を切断して体から分離します
手記：これには、他の臓器への不注意な損傷を避けるために、内臓から脊髄を慎重に解剖する必要があります(図1a)。
- 5 mLの0.2 μmフィルター滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む3 x 10 cmシャーレで10秒間順次洗浄し、余分な組織を除去します。
- 5 mLのフィルター滅菌PBSを充填した22Gの針とシリンジを脊柱の尾側端に挿入し、頭蓋で洗い流し、コードを4番目のシャーレに排出します(図1b)。
- 氷上で5 mLのHABG(表1)を入れた15 mLのチューブに脊髄を採取します。脊髄をつぶさないように注意してください。
- 同腹仔の子犬ごとに手順1.1〜1.8を繰り返します.
手記：理想的には、このプロセスは、健康なニューロンの分離を確保するために、脊髄あたり30分未満で完了する必要があります。
2. ニューロンの分離
>注:次の手順は、層流フードで実行する必要があります。基本的な滅菌技術に精通していることが期待されます。
- ティッシュミンチ
- 脊髄の入ったチューブを取り、軽く振って組織を懸濁させます。
- チューブからティッシュを60mmのガラスシャーレに注ぎ、カミソリの刃でさいの目に切って~0.5mmの細かいピースを作ります。
- ワイドボアピペットで組織を5mLのHABGが入った15mLチューブに移します。
- 30°Cのウォーターバスに30分間入れて、この温度で細胞を平衡化させます。細胞を流体に懸濁するのに十分なだけシェーカーに置いてください.
手記：このステップは、氷から消化媒体への移し替え時に細胞に衝撃を与えないようにするために行われます。細胞を30°Cに保つことで、37°Cでの代謝の増加に伴う細胞死を減少させることができます。
- 消化培地を準備します(表1)。
- 密度勾配を準備します(表1)。
- 表1に示すように、4つの層のそれぞれを4つの別々の15 mLチューブに調製します。
- 各層から1 mLを新しい15 mLチューブに加えます。一番下のレイヤー 1 から始めて、一番上のレイヤー 4 に到達するまで順番に追加します。追加中にレイヤーを乱さないでください。
- PDLコーティングされたプレートを洗浄します。滅菌水で数分間洗ってから、残っている水分を取り除き、1時間乾燥させます。
- 組織を消化培地に移します。
- 組織含有チューブを30°Cのシェーカーウォーターバスから取り出し、数分間沈殿させます。
- 消化培地チューブを37°Cのウォーターバスから取り出し、ルアーロックシリンジに吸引します。
- 組織含有チューブから余分なHABGを吸引します。.
- シリンジにLeur-lock 0.2 μmフィルターを使用して、組織含有チューブに消化培地を追加します。
- チューブを30°Cのウォーターバスに30分間入れ、細胞を液体に懸濁させるのに十分なだけ振とうします
手記：細胞を消化培地に長時間保持したり、温度を高くしすぎたりしないことが重要です。これは、過剰な消化につながり、組織がゼラチン状混合物に浮遊する可能性があります。
- この間に、ラミニンをコーティングします。
- トリチュレーション(すなわち、組織から細胞を分離する)を行います。
- 振とうしている30°Cのウォーターバスからチューブを取り出し、数分間沈殿させます。
- 過剰な消化媒体を吸引します。.
- 組織を2mLのHABGに懸濁します。
- ナローボアピペットを使用して、45 s.
に対して 10x を回転させます
手記： これはおそらく最も重要なステップであり、適切に行わないと歩留まりが大幅に減少する可能性があります。
- ティッシュをピペットに吸引し、すぐに内容物を空に戻します。
- 空気の導入は、生存可能な収量を大幅に減少させるため、避けてください.
手記：理想的なピペットは9インチのガラスピペットです。ピペットの先端は、粗い表面を滑らかにするためにファイヤーポリッシュする必要があります。次に、クロロホルム中のジクロロジメチルシラン(DMDCS)の1:20溶液に入れてシリコン化し、O / Nを放置する必要があります。その後、ピペットを取り外して自然乾燥させます。その後、滅菌のためにオートクレーブする必要があります.
注意： DMDCSとクロロホルムは引火性が高いため、シリコン処理はドラフト内で行う必要があります。
- 上清の上部2 mLを吸引し、「collection」とラベル付けされた新しい15 mLチューブに入れます。
- 手順2.7.3〜2.7.5をさらに2回繰り返します(細胞収集チューブは最後に6mL必要です)。
- グラジエントの中断を避けながら、ステップ2.2で調製したグラジエントチューブに収集チューブの内容物をゆっくりと移します。
- この時点で、事前に準備した神経基礎培地(表1)を冷蔵庫から取り出し、37°Cの浴で温めます。
- ニューロンを浄化します。
- グラジエントチューブを800 x g、22°Cで15分間遠心分離します。
- ピペット(図2)で目的の層を採取し、新しい15 mLチューブに入れます。最高純度のニューロン単離(すなわち>90%)には、第3層を収集します。低純度(>70〜80%)で収量を増やすには、レイヤー2と3を収集します。
- 新たに収集した層に5 mLのHABGを加えて、密度勾配を希釈します。
- 200 x gで22°Cで2分間遠心分離します。
- 上清を捨て、5mLのHABGに再懸濁し、ペレットをフリックして細胞を懸濁します。
- 200 x gで22°Cで2分間遠心分離します。
- 上清を捨て、3 mLの神経基礎培地に再懸濁し、ペレットをフリックして細胞を再懸濁します。
グラデーション
| メディア | 貯蔵 | 材料 | 準備 |
| HABG | 4°C/24h | | 100mL | - 4°C冷蔵庫でB27を解凍します O/N
- フィルター滅菌(0.22μm) |
| ハイバネートA | 97.8 mL |
| B27 [2%] | 2 mL |
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.25mL |
| 神経基礎メディア | 4 °C/1週間 | | 100mL | - 4°C冷蔵庫でB27を解凍します O/N
- フィルター滅菌 (0.22 μm)
- 50mLの小分けを50mLのチューブに分注します(4°Cで保存します)。 |
| 神経基礎A | 97 mL |
| B27 [2%] | 2 mL |
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.25mL |
| ペン/溶連菌 [1%] | 1 mL |
| 消化媒体 | 隔離の日 | | 10 mL | - 激しく振ってください
- 37°Cの浴槽に30分間置く(使用の30分前に準備するのが理想的です)
- フィルター滅菌(0.22μm) |
| HA-Ca | 10 mL |
| パパイン | 25 mg |
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.025 mL |
| 密度勾配 | 隔離の日 | | 1 | |
| レイヤー | オプティプレップ | HABGの |
| (0.13mL) | (5.29 mL) |
| 1 ボトム | 0.26ミリリットル | 1.24ミリリットル |
| 2 | 0.19ミリリットル | 1.31ミリリットル |
| 3 | 0.15ミリリットル | 1.35ミリリットル |
| 4 トップ | 0.11ミリリットル | 1.39ミリリットル |
>表1:このプロトコルで使用される培地と溶液の調製。
