心肺複合体の脱細胞化:マウスモデルから心臓と肺を脱細胞化する技術

Abstract

出典:Mayorca-Guiliani, A. E. et al.マウス心肺複合体の脱細胞化。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、血管系を通じて界面活性剤の順行性灌流を適用することにより、脱細胞化細胞外マトリックスまたはECMスキャフォールドを生成する方法を示します。その後、構造ECMスキャフォールドを使用して、心肺疾患に関連するECMリモデリングを解析できます。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 死後のマイクロサージェリー

1. CO₂チャンバーを使用してマウスを安楽死させます。
   1. マウスを4Lチャンバーに入れ、0.2 L / minから2分間開始し、3分後に0.8L / minの流量に達するまで増加して、100%CO₂で充填し始めます。マウスは最初の2分間で意識を失い、その後呼吸が停止します(通常は約5分、 ただし、必要に応じて流れを維持することができます)。次のステップに進む前に死亡を確認してください。
2. バリカンで胸部、腹部、マウスの背部を剃り、70%エタノールで消毒します。シェービングは、イメージングまたは生化学分析のためのサンプル上の髪の毛の存在によるアーティファクトの数を大幅に減
らします。
3. マウスをポリスチレントレイに固定し、前肢と後肢、および頭と尾を伸ばします。顕微鏡顕微鏡の下に置きます。
4. メイヨーストレートパターンハサミを使用して、顎下領域から下腹部まで走る皮膚切開で外科的アクセスを確立し、皮下解剖して胸壁と腹膜を露出させます。
5. 顕微手術用ハサミを使用して、胸壁の両側の6番目の肋間腔に沿って大胸筋と小胸
筋を切断します。
6. ストレートパターンのハサミを使用して、前の切開部に沿って胸骨を切断し、次に胸骨をその長軸に沿って切断して胸骨切開を完了し、胸壁の両側を持ち上げてピン留めして心肺複合体を露出させます。
7. 先端が丸いマイクロ鉗子(またはデュモンマイクロ鉗子)を使用して、胸腺と周囲の脂肪組織をアタッチメントから繊細に引き抜くことにより、胸腺と周囲の脂肪組織を切除します。これにより、主要な船が明らかになります。
8. 焼灼器を使用して、下行するカバ静脈を焼灼し、まっすぐなパターンハサミを使用して食道を切断します。
9. 鋭利なマイクロ鉗子を使用して、腕頭静脈と腕頭症、左総頸動脈および左鎖骨下動脈をその下にある組織から分離し、結紮と焼灼を容易にします。
10. マイクロニードルホルダー、シャープなマイクロ鉗子、9-0縫合糸を使用して、腕頭症、左総頸動脈、左鎖骨下動脈の出現の上にステッチを配置します。
11. 腕頭静脈を焼灼します。
12. 顎下唾液腺を正中線に沿って分離し、首の筋肉と気管を露出させます。輪状甲状靭帯を露出させるために筋肉を分離します。マイクロハサミを使用して、靭帯を切開して入り口を開きます。
13. 気管に27Gのカテーテルを導入し、気管が気管支に分岐するまで(つまり、カテーテルへの抵抗が満たされるまで、次に3mm後退するまで)繊細に押します。気管支を乱さないように注意してください。6-0縫合糸を使用して、気管の周りに3針を配置してカテーテルを固定します。
14. マウスを第12胸椎の高さで切片にします。下行大動脈は脊椎の前方に走っており、脊椎と一緒にここで切片にする必要があります。下半分を離してセットします。
15. 大動脈を逆行性カテーテル法で固定し、カテーテルが大動脈弓に達するまでカテーテルを押し出します。9-0縫合糸を使用して、カテーテルの先端から5mm下から大動脈の周りに4針を縫います。

2. 脱細胞化

1. シリコンチューブとルアーコネクタを使用してマウスをポンプシステムに接続します。脱イオン水で200 μL/minで15分間灌流します。脱細胞化中はこの流量を維持します。
2. 灌流剤を脱イオン水で希釈した0.5%デオキシコール酸ナトリウム(DOC)に変更し、一晩灌流します。
3. 灌流剤を脱イオン水で希釈した0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に交換し、8時間灌流します。
4. 脱イオン水で一晩灌流し、SDSとDOCを24時間洗い流します。
5. 脱細胞化した心臓と肺を湾曲したハサミで胸部に付着物を切片化して切除し、1%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシンと0.3μMアジ化ナトリウムを含む脱イオン水を入れた滅菌クライオチューブに4°Cで保存します。足場を生化学分析(質量分析など)に使用する場合は、液体窒素で急速凍結します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
マイクロサージェリー
6-0縫合糸、三角切片針(Vicryl)	エチコン	6301124
9-0マイクロ縫合糸(サフィル)	B ブラウン	G1048611
アドソン鉗子	ファインサイエンスツール	11006から12
歯付きアドソン鉗子	ファインサイエンスツール	11027から12
Castroviejoマイクロニードルホルダー	ファインサイエンスツール	12061-01
マウス安楽死のためのCO2換気チャンバー
脱イオン水(Milli-Q IQ 7000、超純純ラボ用水システム)	メルク	ZIQ7000T0
使い捨てポリスチレントレイ(~30 × 50 cm)
解剖顕微鏡(グリーナフ、両腕グースネック付き)	ライカ	S6 D
ダブルエンドマイクロスパチュラ	ファインサイエンスツール	10091-12
デュモンマイクロ鉗子(2)	ファインサイエンスツール	11252から20
デュモンマイクロ鉗子、先端45°	ファインサイエンスツール	11251から35
バリカン	オスター	76998-320-051
Halseyニードルホルダー(タングステンカーバイドジョー付き)	ファインサイエンスツール	12500-12
静脈内24ゲージカテーテル(Insyte)	BDの	381512
静脈内26ゲージカテーテル(テルモ)	サーフロW	SR+DM2619WX
マヨハサミ(タフカット・ストレート)	ファインサイエンスツール	14110-15
先端がリング状になったマイクロ鉗子	エイスクラップ	FM571Rの
マイクロスプリングハサミ(バンナス、湾曲)	ファインサイエンスツール	15001-08
ニードル(27ゲージ;マイクロランス)	BDの	21018
ペーパータオル(滅菌済み)または手術用ナプキン
鋸歯状ハサミ(セラマカット・ストレート)	ファインサイエンスツール	14958から09
へら(Freer-Yasargil)	エイスクラップ	OL166R
シリンジ(1 mL;プラスチパック)	BDの	3021001
シリンジ(10 mL;プラスチパック)	BDの	3021110
腱ハサミ(ウォルトン)	ファインサイエンスツール	14077-09
脱細胞化
70%エタノール(無水アルコール99.9%);無水アルコールは脱イオン水を使用して70%(vol / vol)に調整する必要があります	李	1680766
脱イオン水(Milli-Q IQ 7000、超純純ラボ用水システム)	メルク	ZIQ7000T0
ルアー-チューブオスフィッティング(1/8インチ)	世界の精密機器	13158から100
ルアー-チューブオスフィッティング(1/8インチ)	世界の精密機器	13158から100
PBS(pH 7.4、10×、Gibco)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	70011044
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140122
蠕動ポンプ(12チャンネル付き)	オーレ・ディッチ	110AC(R)20G75
シリコンチューブ(内径2mm、内径4mm)	オーレ・ディッチ	31399
アジ化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	08591-1ML-F
デオキシコール酸ナトリウム(DOC)	シグマ・アルドリッチ	D6750-100G