マウスモデルからの環状乳頭(CVP)上皮の単離:マウス舌からCVP上皮を分離するための酵素的手順

この記事について

要約

出典:Shechtman, L. A. et al.成体マウス味覚幹細胞由来の舌オルガノイドの生成と培養.J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、マウスの舌からの環状乳頭(CVP)上皮の分離について説明します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. CVPエピセリウムの分離

IACUCの規制に従ってマウスを_CO2窒息で安楽死させ、その後、両側開胸術、頸椎脱臼、斬首、または放血などの承認された二次的方法を行います。
大きな滅菌解剖ハサミを使用して頬を切り、顎を骨折します。舌を持ち上げ、舌小帯を切って舌を口腔の床から分離します。舌を切り取り、Ca²⁺とMg^{2+で滅菌した氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)に集めます}。
カミソリの刃で臼歯間隆起のすぐ前方を切って、前舌を取り外して廃棄します(図1A、破線)。デリケートなタスクワイプを使用して、舌後部の毛や余分な液体を取り除きます。
1 mLシリンジに200〜300 μLの注射酵素溶液(最終濃度:Ca²⁺/Mg²⁺-containing dPBS, diluted from 10 mg/mL stock solution)を満たし、30 G x 1/2 針を臼歯間隆起のすぐ上に挿入します(図 1B、黒い矢印)CVPのすぐ前まで(図1B、黒いボックス)。上皮とその下にある組織(固有層、筋肉)との間のCVPの下および外側の端に酵素溶液を注入します。.注射が行われる間、シリンジをゆっくりと連続的に舌から引き抜きます。
滅菌Ca²⁺/Mg²⁺-free dPBSで室温で正確に33分間インキュベー
極細解剖ハサミを使用して、CVPのすぐ前方に上皮を両側に小さく切り込み、細かい鉗子で上皮を持ち上げて上皮をやさしく剥がします。トレンチ上皮に下にある結合組織がなくなったら、FBSでプレコートした空の2 mLマイクロ遠心チューブに入れます。CVP上皮を剥離する前または後に上皮トリミングを行います(図1C、D)。

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結果

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図1:解剖された舌と剥がれたCVP上皮。 (A)舌を解剖し、臼歯間隆起(破線)のすぐ前方を切開して前舌を切除し、CVPを含む後舌を残します(ブラックボックス)(B)小臼間隆起のすぐ前方に針を挿入し(黒矢印)、CVPの下と横縁に酵素混合物を注入します(ブラックボックス)。(C)CVPトレンチを囲むトリミングされていない剥がれた上皮(黒い矢印)および(D)トリミングされた剥がれたCVP上皮。フォン・エブナーの腺と管(D、黒の矢印)は、トレンチの剥がれに成功した後に見えます。スケールバー:1mm。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号
1 mL TB シリンジ	BDシリンジ	309659
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水とCa²⁺およびMg²⁺	ギブコ	〒10010-023
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水とCa²⁺およびMg²⁺	シグマライフサイエンス	D8662-500ミリリットル
デュモン #5 鉗子	ファインサイエンスツール	11252から30
ウシ胎児血清(FBS)	ギブコ	〒26140-079
1 mL TB シリンジ	BDシリンジ	309659
2.0 mL 微量遠心チューブ	USAサイエンティフィック	1420-2700
外科用ハサミ - シャープ	ファインサイエンスツール	14002-14
エクストラファインボンハサミ	ファインサイエンスツール	14084-08
ビッグディジットタイマー/ストップウォッチ	フィッシャーサイエンティフィック	S407992
実体顕微鏡	ツァイス	ステミSV6
Cohan-Vannasスプリングシザース	ファインサイエンスツール	15000から02
Clostridium histolyticum、I型由来のコラゲナーゼ	シグマライフサイエンス	C0130-1G
ディスパーゼII(中性プロテアーゼ、グレードII)	シグマ・アルドリッチ(ロシュ)	4942078001

マウスモデルからの環状乳頭(CVP)上皮の単離:マウス舌からCVP上皮を分離するための酵素的手順

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