単離マウス胚へのマイクロバブルの注入:生きたマウス胚の血管系にマイクロバブル造影剤を送達する技術

Abstract

出典:Denbeigh, J. M. et al.高周波超音波を使用したマウス胚のコントラストイメージング。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、分離された妊娠後期のマウス胚にマイクロバブル造影剤を注入する手順を示しています。マイクロバブル造影剤ベースの超音波イメージングは、胚の血管環境を視覚化し、特徴付けるのに役立ちます。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マイクロバブルの準備

1. 注射用マイクロバブルの準備
   手記：アシスタントは、「胚へのマイクロバブル(MB)の注入」が開始されたときにこのステップを実行します。各胚は一度注入され、各注入で選択されたマイクロバブルのタイプは、すべてのタイプのマイクロバブルが処置全体に均等に分布し、ランダムな順序で与えられるように、アシスタントによってランダムに選択されます。外科医が注入される気泡の種類に盲目であることを確認してください。
   1. 400 μL の容量で 1 x 10⁸ MB/mL の最終濃度を生成するために必要な気泡溶液のストック溶液の容量を決定します(ストック濃度を使用して容量を計算します)。対応する量の生理食塩水を空の微量遠心チューブに分注します。
   2. 選択したマイクロバブルバイアルを穏やかに撹拌し、21Gの針を使用して、溶液の余分な容量(上記で計算したものより~50μL大きい)を1mLシリンジに引き込みます。空の微量遠心チューブにマイクロバブルを注入します。
   3. 必要な量のマイクロバブル原液をピペットで取り、生理食塩水の分注に加えます。ピペットの先端で優しく攪拌しながら混ぜます。
   4. 希釈したマイクロバブル溶液を21Gの針を使用して清潔なシリンジに引き込みます。針を取り外し、シリンジから気泡を取り除き、ルアーとチューブを取り付けます。溶液をチューブの端にゆっくりと押し込み、気泡が発生しないようにします。
   5. シリンジをシリンジ輸液ポンプセットに挿入して、マイクロバブルを20μL / minの速度で分配し、総容量20μLで、引っ張ったガラス針をチューブの端に取り付けます。ポンプを注入ステージに近づけます。

>2. 胚へのマイクロバブルの注入

1. 冷やした培地皿から1つの胚をランダムに選択して(穴あきスプーンで)取り出します。ステレオスコープの下の超音波ステージにある解剖皿に置き、細い鉗子で卵黄嚢と羊膜を取り除き、血管新生が最も少ないように見える側(反月経側)から切断/裂けます。これは、頭部領域に隣接する領域を貫通することで最も簡単に実現できます。
   1. 胚を内側から取り除くのに十分なほど切りますが、それ以上は取りません。粘土の小片を使用して解剖皿を安定させます。
2. 胚の周りから嚢を優しく動かします。胎盤と臍帯血管を前にして、胚を横向きに置きます。昆虫ピンを使用して、卵黄嚢(4ピンを推奨)と胎盤の端を必要に応じて固定します。主要な船舶は避けてください。
3. 胚が蘇生するまで、予熱した45°CのPBSで胚を洗浄します。臍帯静脈とそれに関連する血管ネットワークを特定します。注入が快適に行えるように皿を配置します。
   手記：温まると、胚の血液が流れ始め、目に見えて臍帯動脈に送り込まれます。流れが最初に始まったとき、静脈は真っ赤になり、両方の血管の血液はすぐに同じように見えます。臍帯静脈から生じる枝は、通常、臍帯動脈からの枝を胎盤表面に重ねます。
4. 胚が蘇生したら、温めたUSジェルで覆います(胎盤は除く)し、胚の周りから気泡を(細い鉗子を使用して)繊細に取り除きます。温めたPBSを皿に盛り付けます。
   手記：PBSシリンジとゲルシリンジの溶液レベルに注意し、必要に応じて加熱ビーカーにバックアップシリンジを追加します。
5. 解剖皿の端にある大きな粘土のボールにガラス針を取り付け、針の端をPBSに挿入します。胎盤椎間板の絨毛膜表面にある静脈を選択し、主枝からできるだけ離れて、はさみを使用して先端をサイズにトリミングします。注入は、先端をわずかな角度でカットすると最も簡単です。スプリングハサミの端を使用して、ガラスのギザギ
ザの端を取り除きます。
6. シリンジポンプを使用して、マイクロバブル溶液を20μL / minでガラス針にゆっくりと注入し、針先からすべての空気が排出され、マイクロバブルがPBSに自由に流れるのが見えるようにします。ポンプを停止し、注入量を20μLにリセットします。注射中は、胚の血管系に空気が入らないようにしてください。
7. ガラス針の先端を胎盤の静脈の1つにそっと挿入し、動かないことを確認します。ステレオスコープヘッドを振り離し、トランスデューサーを胚の上に配置します。イメージングを開始します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
氷
0.9%塩化ナトリウム(生理食塩水)	ホスピーラ	0409-7984-11
リン酸緩衝生理食塩水 [1x]	シグマ	D8537	1x、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし
超音波造影剤、ターゲットレディおよびノンターゲット	マイクロマーカー;VisualSonics株式会社
超音波ジェル(アクアソニック100、無色)	CSPメディカル	133-1009
アイスバケツ	コール・パーマー	RK 06274-01
イメージングプラットフォーム	VisualSonics株式会社	統合レールシステム
光源, 光ファイバー	フィッシャーサイエンティフィック	12-562-36	理想的には調整可能なアームがあります
ルアー (12)、ポリプロピレン製バーブ付きメス 1/4-28 UNF スレッド	コール・パーマー	45500から30
マイクロ超音波システム、高周波	VisualSonics株式会社	Vevo2100
針、21ゲージ(1")	VWRの	305165
穴あきスプーン(モリア)	ファインサイエンスツール	MC 17 10373-17
ピン(6)、黒色アルマイト処理、微細0.15 mm	ファインサイエンスツール	26002-15
シリンジ、1 mL Normject	漁夫	14*817*25
シリンジ輸液ポンプ	バイオオオヤマネコ	NE-1000
ピペッター [2-20 μL, 20-200 μL, 100-1,000 μL]	エッペンドルフ	Research Plus 調整可能 3120000038; 3120000054; 3120000062
ピペッターチップ [2-200 μL, 50-1,000 μL]	エッペンドルフ	EPT.I.P.S.の 22491334; 022491351
鋏
ガラスキャピラリー、フィラメント付き1 x 90 mm GD-1	成茂	GD-1
ガラスニードルプーラー	成茂	PN-30
チューブ、エッペンドルフ	VWRの	20170-577
チューブラック (3)	VWRの	82024-462
ホットプレート	VWRの	89090から994
シリンジ(10個)、30 mL	VWRの	CA64000-041
超音波トランスデューサ、20 MHz	VisualSonics株式会社	MS250