スワブを用いた結膜共生細菌の単離:マウスモデルの結膜から共生細菌を単離する技術

要約

出典:Smith-Page, K. et al. マウスにおける結膜共生分離と同定。J. Vis. Exp. (2021年)

このビデオでは、眼結膜から生存可能な共生細菌を分離するための綿棒ベースの技術について説明しています。この技術は、病原体に対する防御的な役割を果たす結膜の共生細菌マイクロバイオームをプロファイリングするために使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 目のスワブの準備、作業場のセットアップ、マウスの目のスワブ、サンプル濃縮

1. 滅菌アイスワブ<br />を準備します 手記：滅菌アイスワブは、綿の中綿の繊維薄層で薄くコーティングされた木製のつまようじで、自家製です。
   綿棒と
   1. つまようじの適切な量のオートクレーブは、綿棒するマウスの数に対して
   。
   2. 親指と人差し指で半センチの長さの綿の中綿をつまみます。親指と人差し指で端を引っ張って平らな単一の多孔質層を形成し、中綿がバラバラになる直前に停止して中綿をからかいます(伸ばした中綿全体に散らばった綿の小片は許容されます)。
   3. つまようじの先端に伸ばしたピースをねじったときに軽く保持することにより、つまようじの鋭い端の1つに中綿を巻き付けます(図1を参照)。「完成した」アイスワブには、先端に非常に薄い綿の層が張られており、先端から約2分の1から1センチメートル伸びています。
   4. 「完成した」綿棒を小さなビーカーに挿入し、綿棒を下にして蓋をします。オートクレーブ。
2. ワークスペースのセットアップ
   1. 2 mLのケタミン(100 mg / mL)、400 μLのキシラジン(100 mg / mL)、および27.6 mLの滅菌生理食塩水(0.9% NaCl in dH₂O)を含む麻酔を滅菌50 mL滅菌遠心分離チューブに調製します。.麻酔を滅菌し、分注してすぐに使用できます(4°Cで1ヶ月間保存することができます;使用前に常に室温に平衡化させてください)。
   2. 汚染を最小限に抑えるために、消毒剤で作業エリアを清掃して清掃します。
   3. 0.5 mLの滅菌Brain Heart Infusion培地(BHI)を標識1.5 mLの滅菌マイクロ遠心チューブ(マウスおよびコントロール1本につき1チューブ)に分注し、マイクロ遠心ラックに並べます。ラックを氷の上に置きます。
   4. マウス麻酔ステーション(実験マウスを含むケージ、空の滅菌ケージ、室温麻酔、25Gの針と1mLの注射器)、目のスワブステーション(氷上のBHIを分注、滅菌した目のスワブ、清潔なペーパータオル、70%イソプロパノールスプレー)、プレーティングステーション(室温血液寒天プレート、10μLピペット、 10 μL滅菌使い捨てチップ、バイオハザード廃棄物容器)。
3. アイスワビング
   1. マウス体重1gあたり10μLの麻酔薬を、ケタミンとキシラジンをそれぞれ腹腔内に投与し、各成体マウスに投与し、オートクレーブ滅菌したケージに入れます。後足パッドを絞って麻酔をテストします。適切な麻酔を示す動きはありません。
   2. 片方の手を麻酔マウスのみの処理に割り当て、もう一方の手を目の綿棒と培養物のみの処理に割り当てます。綿棒の場合は、完全に麻酔をかけたマウスをケージから取り出します。左目を露出させて、横向きに配置された清潔な作業面の上に置きます。手袋をはめた手にイソプロパノールをスプレーし、清潔なペーパータオルで乾かします。
   3. 専用のメディアハンドリングハンドを備えたBHIマイクロ遠心チューブのラベルが貼られたキャップを外します。チューブを氷上のマイクロ遠心分離機ラックに戻し、アイスワブの綿でコーティングされた先端をBHIに浸し、アイスワブをチューブから引き出し、先端をインナーチューブに対して2回回転させて余分な液体を取り除きます。
   4. マウスを扱っている手で、マウスの首筋をそっと持ちます。もう一方の手で、目の綿棒の先端を左目の内側結膜領域に置きます(図2Aを参照)。眼球を軽く押し下げ、綿棒を窓洗いの動きで(図2B)下まぶたと目の間で前後に10回動かします。一定の圧力を維持します。
   5. 毛皮に触れずに、綿棒の先端を挿入された場所に対して垂直にそっと取り外し、綿棒の綿を下にして、BHI培地が入ったラベル付きのマイクロ遠心チューブに直接入れます。綿棒で拭いた目に潤滑性の点眼薬を塗ります。
   6. マウスをケージに戻します。
   7. 綿棒を氷の上に10〜15分間放置し、滅菌した手袋をはめた手で先端をメディアに10回転混ぜて目の綿棒を取り除きます。マイクロ遠心チューブの内壁に対して先端を回転させて、綿棒を5回転させて引き出します。綿棒はバイオハザード容器に廃棄してください。
   8. 各マウスとコントロールサンプル(皮膚または毛皮の綿棒)について、手順1.3.2から1.3.7を繰り返します。各綿棒の間に手袋を適切に滅菌します。
4. 濃縮
   1. チューブを37°Cで1時間静的にインキュベートすることにより、サンプルを濃縮します
   2. インキュベーション中に、マウス1匹につき室温のトリプチカーゼ大豆1種を5%ヒツジ血液寒天培地プレート(TSAプレート)で標識し、半分に分けます。
   3. 眼球スワブ培養インキュベーション後、濃縮サンプルをインキュベーターから取り出し、氷の上に置きます。
   4. サンプルを簡単にボルテックスして混合し、図3Aの概略図に従ってプレート化します。サンプル10μLをTSAプレートに分注し、プレートを傾けてストリップを形成し、2回繰り返します。
   5. プレートの分割線の反対側で、サンプル10μLを寒天上に点在させ、9回繰り返します。
   6. プレートを37°Cで18時間、2日間、および4日間インキュベートします(寒天プレートが乾燥するのを防ぐ清潔なチャンバー内)。ストリップ内のコロニーをカウントし、形態を記録し、形態学的に類似した分離株の綿棒あたりのコロニー形成単位(CFU)を計算します。ストリップに捕らえられていないユニークな生物のドットを見てください。

結果

図1:社内のアイスワブ。
(A)滅菌爪楊枝の先端と人差し指の間に約1cmの細い綿の中綿を挟み、綿が爪楊枝の先端に完全に巻かれるまで、人差し指に対してわずかな圧力を維持しながら爪楊枝を転がしました。(B)アイスワブの例。

図2:マウス結膜眼スワブの配置。
(A)BHIウェットアイスワブの先端を、麻酔をかけたマウスの左目の内...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.1 から 10 μl ピペットチップ	USAサイエンティフィック	1110-300	使用前のオートクレーブ
0.5 - 10 μl エッペンドルフピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-690-026
1mlシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	BD309623	各アイスワブグループに1本のシリンジ
1.5 ml エッペンドルフチューブ	USAサイエンティフィック	1615-5500	使用前のオートクレーブ
1000 μ mlピペットチップ	USAサイエンティフィック	1111-2021	使用前のオートクレーブ
200 から 1000 μl Gilson ピペットマン (P1000)	フィッシャーサイエンティフィック	F123602G
25Gの針	フィッシャーサイエンティフィック	14-826AA	目の綿棒グループごとに1本の針
3 % 過酸化水素	フィッシャーサイエンティフィック	S25359
37°Cインキュベーター	ラボ用機器
70 % イソプロパノール	フィッシャーサイエンティフィック	PX1840-4
アナセド注射(キシラジン100 mg / ml)	サンタクルスアニマルヘルス	SC-362949Rxの
ブンゼンバーナー	ラボ用機器
清潔なペーパータオル	ラボ用機器
綿の中綿/滅菌ロールコットン	CVSの
ケタミン(100mg/ml)	ヘンリー・シャイン	9950001
マウス	ジャクソン研究所	C57/BL6J
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィック	08-757-12	マンニトール塩寒天プレート用
RPIブレインハートインフュージョンメディア	フィッシャーサイエンティフィック	50-488525	指示とオートクレーブに従って準備します
SteriFlip (0.22μm孔径ポリエステルスルホン)	EMD/ミリポア、フィッシャーサイエンティフ	SCGP00525	麻酔を滅菌するには
滅菌マウスケージ	ラボ用機器
つまようじ(丸竹)	キッチンの必需品		使用前のオートクレーブと綿棒の準備
トリプチカーゼ大豆寒天 II 5% 羊の血液プレート	フィッシャーサイエンティフィック	4321261	使用する準備ができるまで4°Cで保存
単回使用の点眼薬	CVS薬局		Bausch&Lomb Soothe Lubricant Eye Drops(ボシュロム スース ルーブリッシング 点眼薬)、28本入り、各0.02液量オン

してください ス