多光子顕微鏡法に基づく血管可視化のためのイメージングフィクスチャサポートマウス肝臓病期分類:マウス肝臓の血管の多次元画像を取得するための安定化デバイス支援イメージング技術

要約

出典:Rongrong, W. et al.マウス肝臓組織の血管の多光子顕微鏡観察。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、臓器の安定化後に多光子顕微鏡を使用してマウス肝臓組織の血管内ダイナミクスを観察し研究するイメージング手順について説明しています。多光子顕微鏡は、生体組織をin vivoで高い空間分解能でイメージングすることを可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウスの準備

1. マウスに麻酔をかける
   1. ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg)を注射器で調製します。.
   2. マウス(生後8週齢のオスC57BL/6)を左手でつかみ、腹が上を向き、頭が尻尾より低くなるようにします。腹部の皮膚を75%アルコールで消毒します。
   3. シリンジを右手に持ち、腹部の白い線に針を皮膚の少し右側に3〜5 mm突き刺します。シリンジの針と皮膚が45°の角度にあることを確認し、ペントバルビタールをゆっくりと腹腔内に注入します。シェービング後、マウスの切開部位の周囲を75%アルコールとクロルヘキシジン溶液で交互に3回消毒します。
   4. 麻酔が成功したかどうかは、立ち直反射の欠如によって確認してください。
2. ローダミンBイソチオシアネート-デキストランを尾静脈に注入します。.
   1. 10 mg/mL ローダミン B イソチオシアネート-デキストラン 100 μL をシリンジで調製します。
   2. マウスの尻尾を75%アルコールで拭きます。
   3. 左手でテールを持ち、右手でシリンジを持ち、針を静脈と平行にして100μLの色素を注入します。
   4. 注射後は綿棒で出血を止めてください。
3. 滅菌水で濡らしたガーゼでマウスの腹部の毛皮を浸し、カミソリを使用してマウスの腹部を剃り、毛皮の方向にストロークします。剃毛後、マウスの切開部位の周囲を75%アルコールとクロルヘキシジン溶液で交互に3回
消毒します。
4. 75%アルコールで加熱パッドを拭いた後、加熱パッドを開き、マウスを背面にして加熱パッドに置き、体温を37°Cに保ちます。

2. 体器官イメージングフレームによるマウス肝臓の固定

>注:商用臓器イメージングフレームはまだリリースされていません。

1. 清潔な吸盤を固定位置に置きます。
2. 臓器イメージングフィクスチャ(図1)を取り付け、加熱パッドと吸盤を75%アルコールで拭きます。
3. 吸盤(直径5mm)を真空ポンプホースに接続し、真空ポンプをオンにします。
4. 75%アルコールで滅菌した滅菌テーブルで、マウスの切開部位の周囲を75%アルコールとクロルヘキシジン溶液で交互に3回消毒し、次にマウスの切開部位の周囲を75%アルコールとクロルヘキシジン溶液で交互に3回消毒した後、手術用ハサミを使用してマウスの胸骨下部境界から2cmの皮膚を切り取り、肝臓を露出させます。
5. マウスをヒーターパッドと一緒にホルダーベースに置きます。
6. 吸盤が肝臓を保持するように臓器イメージングフィクスチャを調整します。次に、肝臓が吸盤に付着するように、吸引に30〜35kPaの負圧を使用します(図2)。

>3. 多光子レーザー走査型顕微鏡の調整

1. 多光子顕微鏡の電源を入れ、60x/1.00 W対物レンズを選択します。
2. フレームとマウスを対物レンズの下に固定します。
3. 吸盤の中心であるレンズ全体を覆うことができる通常の生理食塩水を一滴加え、対物レンズを通常の生理食塩水に触れるだけに調整します。
4. コンピューターのアイコンをダブルクリックしてレーザーソフトウェアをオンにし、スイッチをオンにします。次に、電源ボタンを押し続けて、シャッターを3秒間押し続けます。
5. 波長を800nmに設定します。
6. コンピューターを使用して顕微鏡操作ソフトウェアを起動します。
7. Acquisition Settingには、Laser 800を設定します。

結果

図1:体器官イメージングフレーム。(a)加熱パッド:マウスの体温を維持します。(b)ブラケット:マウスとノブで調整可能な吸盤の位置を配置するためのベースを提供できます。(c)吸盤:ブラケットで固定されています。負圧ポンプによって提供される負圧により、肝臓は吸盤の中央にある透明なレンズに吸着します。(d)フレキシブルパイプ:吸盤と圧力ポンプを接続します。圧力ポンプは、吸盤に負圧を供給します。(e)遠心分離管:フレキシブルパイプの中央にある遠心分離管は、これらの液体が真空ポンプに吸い込まれるのを防ぐために、液体を保持できます。(f)負圧ポンプ:フレキシブルパイプで吸盤...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1mLシリンジ×2	湖南省ピナン医療機器技術	YA0551
5W加熱パッド	BiolinkOpticsテクノロジー	BL336
75%無水エタノール	広東省Guanghua Sci-Tech	1.17113.023
吸収性コットンボール	健康衛生王国
マウス用手術器具	RWDライフサイエンス	SP0001-G	ハサミとピンセットが含まれています
多光子顕微鏡	オリンポス	FV1200MPE
臓器イメージングフィクスチャ	BiolinkOpticsテクノロジー	BL336	吸盤、ホース、負圧ポンプ、ブラケットを含む
ローダミンBイソチオシアネート-デキストラン	シグマ	R9379
ペントバルビタールナトリウム	シグマ	P3761-25Gの
シェービングマシン	レイワ	RE-3201