ランゲンドルフ逆行性心臓灌流:単離されたマウス心臓を灌流するためのex vivo技術

要約

出典:Wu, K. et al. 成体マウスからの心房筋細胞と心室筋細胞の同時分離のためのランゲンドルフ法の修正。J. Vis. Exp. (2021年)

このビデオでは、孤立したマウスの心臓のランゲンドルフ逆行性灌流を行います。手術中、上行大動脈に挿入されたカニューレを使用して、冠状動脈を介して灌流溶液で逆行性に灌流することにより、心臓の心臓活動が維持されます。このモデルは、心臓の心臓病態生理を研究するために使用されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 溶液と灌流装置の準備

1. 定流量のランゲンドルフ装置(市販または自作)を組み立てます。図1に簡単な概略図を示します。
2. 表1および表2に示す試薬に従って溶液を調製します。
3. 循環水浴をオンにし、適切な入力温度(当研究室では42.7°C)を調整して、カニューレからの灌流システムの流出が37°Cに達するようにします。
4. 脱イオン水を循環させることにより、灌流システムを洗浄します。滅菌状態が必要な場合は、75%エタノールを灌流システムに15分間通し、続いて脱イオン水(心臓へのアルコール毒性の影響を避けるために少なくとも10サイクル)を実行します。
5. 灌流液循環システムの1サイクルの時間と容量を測定し、次の灌流ステップで何ミリリットルの酸素化チロード溶液をロードするかを決定します。
6. すべての手術器具を希望の方法で滅菌します。
7. 灌流システムの流量を4 mL/minに設定します。
8. 2つのきれいな35mmペトリ皿を準備します—1つはタイロード溶液(ペトリ皿1)を含み、もう1つは溶液1(ペトリ皿2)を含みます。
9. 溶液1を充填した1mLシリンジと、先端までの距離が1mmのところにノッチがある20Gの鈍い鋼製カニューレ針を準備します。カニューレシャフトに3-0縫合糸で緩い結び目を準備します。実体顕微鏡の視野を調整し、カニューレの先端がペトリ皿2の液体表面の下にあることを確認します。

2. 動物の調理法

1. ヘパリン(濃度、1,000 IU/mL、0.2 mL/マウス)をマウスに腹腔内投与し、血栓を避けます。10分後、ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg、I.P.注射)でマウスを麻酔し、マウスが尾/つま先のつま先つまみに反応しなくなることを確認します。.ヘパリン投与の20分後に子宮頸部脱臼を行います。
2. マウスを手術台に移し、マウスを仰臥位に固定し、胸部を75%エタノールで滅菌し、ガーゼまたはナプキンで乾燥させます。

3. 心臓切除術と大動脈カニューレ挿入

術

1. 組織鉗子で剣状突起の皮膚を持ち上げ、組織ハサミで皮膚を通して小さな横切開を行います。皮膚と筋膜の間の鈍い解剖を行い、両側の腋窩に向かってV字型の皮膚の切開を伸ばします。
   1. 胸郭を通して同じ切開トレースを続け、次に、組織鉗子で胸骨をクランプして胸郭を上向きに偏向させ、心臓と肺を完全に露出させます。
2. 湾曲した鉗子を使用して心膜を剥がします。胸腺が大きな血管を覆っている場合は、2つの湾曲した鉗子で胸腺を両側に引き裂きます。湾曲した鉗子で心臓の基部を尾に向かってそっと引っ張り、「Y」字型の血管(大動脈とその枝動脈)が見えるまで
引きます。
3. カニューレ挿入と比較のために大動脈の異なる長さを予約するには、左総頸動脈(図2の緑の線)で大動脈を横断し、一部のマウスで腕頭動脈を同時に切断します。他のマウスの上行大動脈トランセクト(図2の黒線).
   手記：この手順に不慣れな方のために、この手順は実体顕微鏡下でも行うことができます。
4. 心臓を切除し、すぐにペトリ皿1に浸して、残りの血液を洗浄してポンプで送り出します。
5. 心臓をペトリ皿2に移し、必要に応じて細い虹彩はさみを使用して余分な組織を切り取ります。この手順に不慣れな方は、大動脈やその他の心臓構造を誤って切断しないように、実体顕微鏡でこの手順を実行してください。
6. シリンジを押して、大動脈カニューレ挿入前に気泡を排出します。実体顕微鏡下で2つのまっすぐな結束鉗子(滑らかな顎)の助けを借りて、逆行性大動脈カニューレ挿入を行います。カニューレ挿入プロセス全体が液体表面の下にあることを確認します。
7. 大動脈弁への貫通を避け、上行大動脈(左総頸動脈で大動脈を切除したマウス)と大動脈基部(大動脈を上行大動脈で切除したマウス)にそれぞれ深さを調整してください
   手記：大動脈カニューレ挿入の深さ(単に深さと呼ばれる)は、ここではカニューレの先端が大動脈内にある位置、または大動脈が結紮されている位置として定義されます。
8. プレノット3-0縫合糸で大動脈をカニューレノッチに結紮します。シリンジの内容物をそっと押して、残留血液を洗い流します。
   手記：深さが適切に配置されている場合、血液は冠状動脈を離れ、背側静脈から滲出します。心臓と心房付属器が拡大し、青白くなります。
9. カニューレを取り外して、ランゲンドルフ装置に接続します。繰り返しになりますが、気泡が心臓に入らないように注意してください。
   手記：開胸術から初期灌流までの時間は5分を超えてはならないことに注意してください。
10. 心臓灌流の場合、心房に残血がある場合は、まず、酸素化チロード溶液を約10秒間(このプロトコルで使用されるシステムで10秒間流れる液体の量は約0.7mL)投与し、次に溶液1に切り替えます。ただし、心房に血液が残っていない場合は、溶液1で灌流するだけです。約2分間心臓を灌流します。

>表 1.成体マウスCM分離のソリューション。

解決	内容物(最終濃度(mmol/L)、特に指定されていない場合)	著名
灌流液(溶液1)	113 NaCl、4.7 KCl、0.6 KH2PO4、0.6 Na2HPO4、1.2 MgSO4、12 NaHCO3、10 KHCO3、10 HEPES、15タウリン、5グルコース、10 2,3-ブタンジオン一酸素(BDM)	これは4°Cで3日間保存でき、実験当日にグルコース、タウリン、BDMを添加します。各心臓に200mLの灌流液を調製します。
Tyrodeの解決策(解決策2)	140 NaCl、4 KCl、1 MgCl2、10 HEPES、1 CaCl2、5グルコース	実験当日にCaCl2とグルコースを添加し、室温(28-30°C)で飽和NaOHを添加し、PHメーターでpHを7.3-7.4に調整します。

>表 2.成体マウスCMの分離と保存のためのソリューション。

解決	内容	著名
消化液(溶液3)	25 mL 溶液 1、6μL 100 mM/L CaCl2、25mg コラゲナーゼ II、50μL (2.5 % 10×) トリプシン	それぞれの心に
解決策1を停止します(解決策4)	9 mL 溶液 1、1 mL FBS (ウシ胎児血清)、4 μL 100 mM/L CaCl2	それぞれの心に
解決策2を停止します(解決策5)	9.5 mL 溶液 1、0.5 mL FBS (ウシ胎児血清)、4μL 100 mM/L CaCl2	それぞれの心に
細胞再懸濁液(溶液6)	13 mL溶液1、7μL 1M/L CaCl2、BSA(Bull Serum Albumin)を液体の表面を覆う薄い層を形成できる用量で	それぞれの心に

結果

図 1.組み立てられた改造されたランゲンドルフシステムの概略図。このシステムは、ユーザーにとって経済的で持ち運びに便利です。これは、水用(内径、8mm)と灌流液用(内径、1.5mm)の2つのプラスチックチューブの部分があり、その遠位端はルアーロック付きのPE医療用三方活栓に接続されています。水が入ったガラス瓶で、ゴム栓が熱交換器として形成されています。灌流液は、蠕動ポンプによって熱交換器のプラスチックチューブにポンプで送られ、カニューレに接続された三方活栓から出てきます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2,3-ブタンジオンモノキシム(BDM)	シグマ・アルドリッチ	31550
CaCl2	シグマ・アルドリッチ	C4901
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G7528
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J
KClの	シグマ・アルドリッチ	P9333型
KH2PO4	シグマ・アルドリッチ	P5655型
KHCO3	シグマ・アルドリッチ	237205
MgCl2	シグマ・アルドリッチ	M8266
MgSO4	シグマ・アルドリッチ	M7506
Na2HPO4	シグマ・アルドリッチ	S7907
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S7653
NaHCO3	シグマ・アルドリッチ	S5761
蠕動ポンプ	ロングポンプ	BT100-2J
タウリン	シグマ・アルドリッチ	T0625
ウォーターバス	ジュラボ	ED(v.2)

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