マウス弁間質細胞の単離:マウス大動脈弁からVICを単離および培養するための酵素的方法

要約

出典:Bouchareb, R. et al. Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、2段階のコラゲナーゼ手順を使用して成体マウスの心臓から大動脈弁間質細胞を分離し、その後、少量の増殖培地で培養する方法を示します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 成体マウスからの弁細胞単離前の調製

1. 図1Aに示すすべての手術器具を70% v / vエタノールを使用して洗浄および滅菌し、その後30分間オートクレーブします。
2. 500 μLのペニシリン-ストレプトマイシンを50 mLの10 mm HEPESに加えます。50 mLの1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)のアリコートを調製します。溶液を氷の上に保ちます。
3. 1 mg/mL および 4.5 mg/mL のコラゲナーゼ溶液を調製し、各溶液 5 mL を 15 mL チューブで使用して、すべての手順を実行します。5 mLの1 mg/mLコラゲナーゼを調製するには、5 mgのコラゲナーゼを2.5 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM、ウシ胎児血清(FBS)フリー)および抗生物質(ステップ1.2の1%ペニシリン-ストレプトマイシン)を添加した2.5 mLの10 mM HEPESを混合します。0.22μmフィルターで溶液をろ過し、汚染を除去します.
   手記： 酵素を保護するために、溶液を氷の上に置いてください。
4. DMEM溶液を37°Cに温めてから、以下に説明するすべての手順で使用してください。DMEMに1%ペニシリン-ストレプトマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム、5mLの200 mM L-グルタミン、1mLのマイコプラズマ除去試薬(材料の表を参照)、および10%FBSを補給して、完全な培地を調製します。

2. 弁細胞の分離

1. 実験用に10個の⁶細胞を取得するには、8週齢のマウスを5匹(最低3匹)使用します。マウスを1 mLのイソフルランに浸した小さなティッシュペーパーと一緒に誘導チャンバーに入れますが、組織に触れないようにしてください。動物が完全に麻酔をかけられていることを確認するため。つま先のつま先つまみ反射を確認し、頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。イソフルランを使用して、以下に説明する手順が末期であるため、頸部脱臼の前に痛みを軽減します。.
2. マウスを解剖プラットフォームに置き、前足をカニューレで固定して所定の位置に保持します。胸部と腹部をエタノールで洗浄します。腹部と胸部をハサミで開きます。小さな手術用ハサミで、左心房と左心室の間を切開してマウスを放血します。10mLの冷たい1x PBSで心臓を灌流し、心臓から血液を取り除きます。
3. 心臓を切断し、図1Bに示すように、上行大動脈から3mm離します。実体顕微鏡で大動脈弁を解剖します。心室の中央で心臓を水平に切断します(図1C)。左心室を大動脈に向かって切断し、大動脈弁を慎重に解剖します(図1D-F)。35 mmの小さな組織培養皿にバルブをプールします。
4. 75 mmの細胞培養皿で分離したバルブを、抗生物質(1%ペニシリン-ストレプトマイシン)を添加した5 mLの冷たいHEPES(10 mM)で洗浄し、血液を除去します(図2)。上記のステップ1.3で説明したように、コラゲナーゼ1 mg/mLおよび4.5 mg/mLの15 mLチューブを2本調製します。
   手記：解剖後、無菌のバイオセーフティフード内の分離されたバルブを操作して、汚染を最小限に抑えます。
5. コラゲナーゼI型(1 mg/mL)でバルブを37°Cで30分間、連続振とうしながらインキュベートします(図2)。チューブを150 × gで5分間遠心分離し、ペレットを2 mLのHEPES(10 mM)で1回洗浄し、高速で30秒間ボルテックスします。このチューブの内容物を35 mmの培養皿に注ぎ、細いピンセットを使用して組織の断片を新しいチューブに慎重に移します
   手記：この段階では、VICはまだ組織から解離しておらず、ペレットには組織片が含まれています。内皮細胞による汚染を避けるため、ステップ2.5でボルテックスした後は遠心分離しないでください。
6. ペレットを5 mLのコラゲナーゼI型(4.5 mg/mL)と共に15 mLチューブに入れ、37 °Cで35分間連続撹拌しながらインキュベートし、1 mLピペットで細胞を再懸濁して細胞を分離し、150 × gで4°Cで5分間遠心分離します。
7. 上清を捨て、ペレットを2 mLの完全DMEMに再懸濁します。150 × gで4°Cで5分間遠心分離し、この手順を2回繰り返して細胞を洗浄します
   手記：ペレットにはまだいくつかの組織片があります。
8. ペレットを1 mLの完全培地に再懸濁し、6ウェル細胞培養皿の1ウェルに細胞を最小限の培地でプレートして、培養皿への接着を促進します。細胞をそのまま、5%の二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーターに入れます。
9. 3日後、顕微鏡で細胞をチェックし、組織破片の近くで良好な増殖を確認します。顕微鏡で1,000個の細胞が見えたら、オートクレーブピンセットで組織破片を慎重に取り除き、培地を交換します.
   手記：プレートを乱してはいけません。必要な数の細胞が観察されない場合は、細胞培養皿をさらに2日間インキュベーターに戻します。

結果

図1:バルブ解剖の説明。(ア) 解剖に必要なすべての手術器具の代表画像は、マウスの皮膚を開くにはハサミ2、胸部を開くにはハサミ3が必要です。ピンセット5と6は、皮膚を保持して胸を開くために必要です。 (イ)大動脈から3mmの組織を残します(黒矢印)。(ハ) ハサミ番号4で心室の真ん中で心臓を切断します。(ダ)ハサミで大動脈弁に向かって心臓を開きます 3.細いピンセ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3mm刃ハサミ	F.S.T(エフエスティー)	15000-00
ボンはさみ	F.S.T(エフエスティー)	14184から09
コラゲナーゼI型(125ユニット/ mg)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17018029
DMEM	サーモフィッシャー	11965092
極細グレーフ鉗子	F.S.T(エフエスティー)	11150から10
FBSの	ギブコ16000044
細い鉗子	F.S.T.デュモン
HEPES 1 Mソリューション	STEMCELLSテクノロジー
L-グルタミン 100x	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A2916801
マイコザップ	ランザ	VZA-2011	マイコプラズマ除去試薬
PBSの10倍	シグマ・アルドリッチ
ペンシルリンストレプトマイシン100x	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10378016
ピルビン酸ナトリウム100 mM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11360070
標準パターン鉗子	F.S.T(エフエスティー)	11000から12
外科用ハサミ - シャープ-ブラント	F.S.T(エフエスティー)	14008から14
トリプシン0.05%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25300054