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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています
1. メチレンブルー染料溶液の調製
- メチレンブルーパウダー0.1gを測定します。
- メチレンブルーを10 mLの生理食塩水または1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にボルテックスにより完全に溶解します。
- 10 mg/mLのメチレンブルー溶液をシリンジフィルター(膜細孔径0.45μm)でろ過し、注入時の目詰まりを解消します。
- 滅菌頭皮静脈セット(27 G x 3/4 ")を3 mLの使い捨てシリンジで組み立て、シリンジに3 mLのろ過済みメチレンブルー溶液を充填します。
手記：静水圧とその後の色素の流れを防ぐために、メチレンブルー溶液で満たされたシリンジの上に針先を置きます。.
2. 出生前胚の解剖
- 70%エタノールで解剖はさみと鉗子をきれいにします。
- E18.5またはE19.5で周産期胚を採取するには、まずCO2吸入を用いて妊娠マウスを安楽死させ、次にNIHのガイドラインに従って子宮頸部脱臼を行います
手記：妊娠中の雌マウスは通常、E18.5から出産しますが、腎臓が大きいほど操作が簡単です。したがって、出生に近いE19.5の腎臓は、この分析を実行しやすくなります。しかし、両側性尿路閉塞のある子犬は出生後に死亡します。実験マウスの特性に応じて、適切な採取日/時間を経験的に決定する必要があります。
- 腹側腹部表面に70%エタノールをスプレーし、解剖ハサミと鉗子を使用して腹側に腹腔を開きます。
- 子宮角の先端にある解剖ハサミで切って、子宮全体を持ち上げて体から分離します。
- ペトリ皿で子宮全体を1x PBSですすいでください。
- 解剖ハサミで子宮を分節的に切り取り、解剖鉗子で胎盤脱落膜を取り除き、卵黄嚢の胚を露出させます。
- 最初に卵黄嚢を切除し、次に解剖鉗子で羊膜を切除して周産期胚を放出します。
- 解剖ハサミで胚の首を切り落とします。滅菌ガーゼパッドで余分な血液を拭き取ります。胚を腹側を上にして、イメージング用のデジタルカメラを備えた解剖顕微鏡で固定します。必要に応じて、ジェノタイピングのために尾を採取します。
手記：一度に1つの胚に注射を行います。
- 皮膚を引き裂くことにより、鉗子で胚の腹腔を慎重に開きます。次に、肝臓、胃、腸などの余分な臓器や組織を鉗子で切断または引き出して、背側にある腎臓、尿管、膀胱を露出させることで慎重に取り除きます(図1A)。必要に応じて、滅菌ガーゼパッドで解剖した胚から余分な血液を吸収します
手記：過剰な血液は、染料注射のための腎盂の識別を妨げます。
>3. 腎盂へのメチレンブルー染料の注入と染料の流れのモニタリング
- 静水圧により針先からメチレンブルー溶液を排出することにより、針とチューブの気泡を取り除きます。染料溶液の入ったシリンジを針先の高さより上に持ち上げて流れを開始し、次にシリンジを下げて流れを止めます。
- 近位尿管の近くの腎盂に針を挿入し、一度置いたら邪魔しないように注意してください。腎臓に色素を注入して、尿路閉塞を特定します。
手記：異常な腎臓に染料を注入するには、まず、尿路閉塞を特定するのと同じ方法に従います。
- シリンジを約20cm持ち上げて静水圧を与え、15μL〜60μLの染料溶液を流します。シリンジを胚からこの高さまで上げると、流速は約3μL/sになります。
- 染料の青色を最初に腎盂から開始し、次に尿管の長さ、最後に膀胱内腔で監視します.
手記：尿管が膀胱に適切に挿入されている場合、膀胱内腔内に弱い染料の色が現れるのを見るのに約5秒かかります。膀胱内腔に染料の色が現れない場合は、約15秒間、ブロックされた部位に染料が蓄積するのを待ちます。
- シリンジを下に置いて染料の流れを止め、腎臓から針を取り外してください。
- 色素溶液でトレースした腎臓、尿管、膀胱を、実体顕微鏡に接続されたカメラとイメージングプログラムを使用して撮影します。
- 腎臓の水腎症、水尿管、および染料溶液の最終位置を実験ノートに記録します。
- ステップ3.1から3.5で説明されているように対側腎臓の注射を行い、合計で約20秒の色素の流れを許可します.
手記：膀胱内腔は、尿管が膀胱内腔に適切に挿入されている場合、強い青色で示される染料溶液で満たされます。尿路接合部閉塞の評価後、尿管と膀胱を固定して切片化することができます。
