マウス胞卵子の単離:新たに収穫されたマウス卵巣から胞卵子を単離する方法

要約

出典:Monti, M. et al.核小体クロマチン組織に基づくマウス胞状卵子の単離と特性評価。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、採取したばかりのマウス卵巣からの胞状卵子の分離について説明しています。これらの胞状卵母細胞は、さらなる特性評価および発生研究に使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 動物

1. 3〜6週齢の成虫の雌マウスを、温度と湿度が制御された部屋に保管します(フェーズは12L:12Dで、自由に給餌します)。
2. マウスに2.5IUの妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG)を腹腔内に注射し、卵胞刺激ホルモン(FSH)の効果を模倣して卵胞の成長を刺激します。.48時間後に胞子卵子の収集のために卵巣を分離します。以前にPMSGを注射した雌マウスを、標準的なガイドラインに従って安楽死させます。
3. 卵巣を体腔からすばやく取り出し、M2培地を含むシャーレに入れて、その後の卵子の分離を行います(セクション3を参照)。
   1. 腹壁を覆う皮膚を切開し、続いて滅菌解剖ハサミを使用して腹膜を切開します。切開部を開いて腹部を露出させ、滅菌ピンセットを使用して片側の腸を動かし、子宮管の位置を特定して、膀胱から始まるV字型を形成します。
   2. 腎臓の下にある卵巣を観察します。滅菌ピンセットで各チューブを保持し、卵巣の底に小さな切開をして放出します。事前に平衡化された培地を含むシャーレの底にある両方の卵巣を移します。

2. ホルモン剤の調製

1. PMSG(異なるストック濃度で入手可能)を滅菌等張生理食塩水で希釈し、適切な注入量で0.1 mLあたり2.5 I.U.ホルモンの作業濃度を得る
   手記：ホルモン溶液は0.5 mLチューブに分注し、使用日まで-20°Cで保存する必要があります。希釈したアリコートを-20°Cで3か月以上保管しないでください。解凍後、連続注射を行う場合は、ホルモン溶液のアリコートを+4°Cで保存し、4日以内に使用してください。

3. 胞状卵子の分離

適切な卵子の分離のために:

1. 卵子単離手順を開始する前に、M2培地(M2)を5%CO₂および37°Cで少なくとも1時間平衡化します。2つのシャーレ(35 mm x 10 mm)を準備し、1つは卵巣穿刺用の1 mLのM2を入れ、もう1つは卵巣からの分離後の卵母細胞移植用の鉱油(~1.5 mL)で覆われたM2の小さな滴(20 μL)を準備します(ステップ3.4〜3.6を参照)。両方のペトリ皿をインキュベーターに5%CO₂および37°Cで保管します。
2. 卵子の分離手順中に実体顕微鏡を使用してください。
卵
3. 子を採取するための薄い口のガラス製ガラスピペットを、水平に保ったまま(ピペットの端を両手で保持)伸ばし、ブンゼンバーナーからの垂直の炎にかけます(図1)。
   1. ガラスが溶け始めたら、ピペットを炎から取り出し、すばやく引っ張る動作を実行して目的のピペットを取得します。余分なガラスをピペットの狭い部分に近いところに爪でしっかりと切り込み、内部の毛細血管の長さと直径を調整します。細い毛細血管の内径が ~100 μm で、卵子の直径 (~80 μm) よりわずかに大きいことを確認します。
   2. マウスピペットは、吸引器チューブの一方の端を引っ張ったピペットに適切な先端で接続し、もう一方の端を口の中に入れて歯で固定します。
4. 滅菌ピンセットを使用して卵巣を採取し、細胞培養シャーレ(35 mm x 10 mm)の底に沈着させます。それらを、37°Cおよび5%_CO2で平衡化したM2 1 mLで覆います(図2)。
5. 滅菌インスリン注射針で卵巣の胞状卵胞を優しく穿刺し、M2の胞子卵子を放出します(図3)。
6. 細いパスツールピペットで卵子を静かに口にピペットで移し、卵胞細胞やその他の可能性のある組織の破片(図4A)を取り除き、胚培養に適した鉱物油で覆われたM2の小さな滴(20μL)の底に沈殿させます(事前に調製しました。図4B)
   手記：卵母細胞の透明帯に付着したすべての卵丘細胞を、M2のいくつかの異なる滴を連続的にピペッティングして除去することが重要です。このステップは、培地のpHの変化を避けるために、できるだけ早く実行してください。

結果

図 1.ガラスパスツールピペットとブンゼンバーナーを使用したマウスピペットの準備。

図 2.事前に温めて平衡化したM2培地で満たされたペトリ皿の無傷の卵巣。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PMSGの	シグマ	G4527
エンブリオマックス M2	ミリポア	MR-015-PD
鉱油	シグマ	M8410
細胞培養ディッシュ 35 mm x 10 mm	コーニング	430165
μ皿35 mm、高ガラス底	イビディ	81158
ピペットパスツールホウケイ酸	コーニング	7095D-9
キャリブレーション済みマイクロピラリーピペット用のアスピレーターチューブアセンブリ	シグマ	A5177 (英語

の )