胆道系レジンキャスティング:放射線不透過性樹脂注入を用いたマウスモデルにおける胆道系の3次元構造解析技術

要約

出典:Hankeova, S. et al. DUCT: Double Resin Casting followed to Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis. J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、3D胆道構造を理解するための胆道系レジンキャストの手順を説明しています。この手法は、胆道系の内径とネットワーク接続性に関する洞察を提供し、肝臓再生分析に使用できる可能性があります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ダブルレジンインジェクション

1. 準備
   1. 樹脂溶液を調製します。ダブルシステムレジンインジェクションの場合は、手順1.1.2-1.1.4で説明したように、黄色と緑色の両方のレジンを準備します。
   2. 希釈した樹脂をマウス1匹につき1 mL分調製します。
   3. イエローレジン:黄色のシリコーンゴム(高放射線透過性)を透明希釈剤で3:1に希釈し、注入用のイエローレジンを調製します。
   4. グリーンレジン:青色のシリコーンゴム(検出不能な放射線透過性)と透明な希釈剤を1:1に希釈して混合し、青色レジンを調製します。グリーンレジンを生成するには、希釈した青色レジンと希釈したイエローレジンを1:1の割合で混合します。色が均一になるまで、緑色の樹脂を徹底的に渦巻きます
      手記：青色樹脂は、マイクロCTでは検出できない放射線透過性が非常に低いため、黄色の樹脂で希釈して放射線容量の異なる2つの樹脂を作成する必要があります
      注意：樹脂には、発がん性物質であるクロム酸鉛が含まれている場合があります。火事で有毒ガスを発生させます。取り扱いには注意し、レジンは有害廃棄物として廃棄してください。
   5. ステップ 1.1.6-1.1.11.
      で説明されているように、チューブを使用して 2 つの注入セット (注入セット #1 と注入セット #2) を準備します 手記：成体マウス(>P30(出生後30日)= P30-2年)の場合、総胆管注射には注射セット#1(外径0.6mmのPE10チューブ)を使用し、門脈注射には注射セット#2(外径0.96mmのPE50チューブ)を使用します。若い出生後マウス(P30まで)の場合は、胆管用と門脈注射用の2つの#1注射セットを準備します(門脈が狭すぎてPE50チューブを収容できないため、注射セット#2はありません)。
   6. インジェクションセット#1を調製するには、PE10チューブを30cmカットし、チューブの一端を手で引っ張ってできるだけ細くなるまで伸ばします(図1A、B、直径約0.15mm、ストレッチされていないPE10チューブは直径0.6mm)。
   7. 伸ばしたPE10チューブの先端を斜めに切断して、先端を斜めにします(図1B)。
   8. PE10チューブの伸びていない端を30G針(図1A、注射セット#1)に接続します。
   9. インジェクションセット #2 を準備するには、PE50 チューブを 30 cm 切断し、チューブの一端を門脈に収まるほど薄くなるまで手で引っ張って伸ばします (図 1A、B、約 0.7 mm、伸ばされていない PE50 チューブの直径は 0.96 mm)。
   10. 伸ばしたPE50チューブの先端を斜めにカットして、先端を斜めにします(図1B)。
   11. PE50チューブの伸びていない端を23Gの針(図1A、注射セット#2)に接続します
       手記：各インジェクションセットは、樹脂がシリンジとチューブ内で硬化するため、1回のインジェクションにのみ使用できます。マウスの総胆管と門脈のサイズに基づいて、マウスの年齢、遺伝子型、表現型に応じて、伸ばして斜めにした先端のサイズを調整します。チューブのサイズとフィット感がわからない場合は、切開後、チューブに樹脂を充填する前に、チューブを適切なダクトまたは容器に挿入してください。チューブが幅が広すぎてダクト/容器に収まらない場合は、さらに伸ばします。
   12. イソフルラン吸入により動物に麻酔をかけます (最初の 4% は誘導チャンバーで、~2% はノーズ コーンを使用します)。
   13. マウスがノーズコーンを通じてイソフルランを呼吸している間、マウスを解剖パッドの換気ベンチに置きます。.動物が意識を失っていることを確認するには、研究所/IRBが推奨する方法、例えば、足の1つをつまむなどしてください
       注意：イソフルランは、吸入時に眠気やめまいを引き起こし、長期または反復暴露を通じて心血管系や中枢神経系に損傷を与える可能性があります。.吸い込まないでください。物質は換気の良いベンチと換気の良い場所で取り扱ってください.
       手記：心臓灌流と互換性がある限り、別の麻酔方法を使用することが可能です。
   14. 動物が意識を失ったら、毛皮からの干渉を防ぐために腹側に70%エタノールをスプレーします。
   15. 皮膚ハサミを使って、腹腔の正中線から皮膚、筋膜、筋肉層を切開し、胸腔まで切開して内臓を露出させます。
   16. 鉗子で剣状突起をつかんで胸骨を持ち上げ、両側の横隔膜と胸郭を切って心臓と肺を露出させます。
   17. 胸郭の左右にある肋骨をハサミで切り込み、胸郭を取り外します。肝臓を傷つけないように特に注意してください。
   18. まっすぐな鉗子を使用して、心臓を肝臓に向かって引っ張り、右心房を切り取ります。
   19. 蠕動流ポンプに接続されたバタフライ針(23G)を左心室に挿入します。マウスをハンクスバランス塩溶液(HBSS)とヘパリン(マウス体重1U/g)で経心的に灌流します。灌流速度 5 mL/分で 3 分間灌流
       手記：マウスが正しく灌流されている場合、内臓、特に肝臓は青白くなります。代わりに、肺が白くなっている場合は、針を右心室に挿入し、再配置する必要があります。灌流後、マウスは放血され、ノーズコーンとイソフルランから取り外すことができます。
   20. イソフルランポンプの電源を切ります。

2. レジンインジェクション - 胆道系レジンキャスト

1. マウスを解剖顕微鏡に動かし、腹部を上にして尾を実験者に向けて、実験者から離れます。関心のある解剖学的ランドマークを図2Aに示します。
2. 腸を横に動かして、下大静脈(図2A)を見つけます。スプリングハサミを使用して、下大静脈に小さな横切開を行い、肝血管圧の解放を可能にします(図2Bi)。
3. 手順1.2.4〜1.2.6で説明されているように、総胆管と門脈を露出させます。
4. リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で湿らせた綿棒を使用して、腸と膵臓を(実験者の)右側に移動します。
5. PBSで濡らした綿棒を使用して、肝臓の腹側を心臓に向けて反転させ、内臓表面と肺門部を露出させます。
6. 肺門部から膵臓を横切ってオッディ括約筋の腸に通じる総胆管を見つけます(図2Bii、黄色の点線で囲まれた総胆管、黒い矢印はオッディ括約筋を指しています)
   手記：PBSを振りかけることにより、肝臓が手順全体で湿っていることを確認してください。
7. ストレート鉗子を使用して、総胆管から周囲の組織(面積~5mm)をクリアします。絹の縫合糸(サイズ4-0、0.17 mm、長さ3-5 cm)を総胆管(図2Bii)の下に置き、総胆管の周りに緩いオーバーハンドノットを結びます(図2Biii).
   手記：肺門部とオッディ括約筋の中間、門脈からある程度離れた場所で結び目の領域を選択し、縫合糸が総胆管の周りで締められた後、門脈の注入を妨げないようにします。
8. スプリングハサミを総胆管に対して平らに保持して、総胆管がオッディ括約筋の隣の膵臓と腸に入る場所で総胆管に斜めに切開します。(図2Biv)、黄色の点線はオッディ領域の括約筋の輪郭を示し、黒い矢印で強調されています)
   手記：これは重要なステップです。横方向ではなく斜めのカットを行い、切開を行います。胆管を切断しないでください。胆管全体を切断すると、チューブの挿入が非常に困難になります。
9. 使用直前に、黄色のレジン1mLを硬化剤50μLと混合し(1mLシリンジに充填して空に)、1mLのルアーシリンジにレジン硬化剤混合物を充填します。
10. 充填されたシリンジをチューブ(セット#1)に接続します。プランジャーを押して、チューブを完全に満たします。樹脂/硬化剤の混合物がチューブの先端から滴り落ちていることを確認します.
    手記：最良の結果を得るために、シリンジとチューブ内の気泡を避けて取り除いてください。
11. 鉗子を使用して、総胆管切開部の周囲をまっすぐにし、チューブを総胆管の開口部に挿入します(図2Bv)、斜めの先端の最も長い端が胆管の背側に向かって下向きになります。この向きにより、レジンが上向きのチューブ開口部からダクトに確実に出ることができます(図2Bv)。
12. 絹糸の結び目を締めて、チューブを総胆管の内側に固定します(図2Bvi)。
13. レジンを総胆管に注入します。胆嚢と個々の肝葉を観察します。
14. PBSで濡らした綿棒で肝臓をマッサージし、レジンを均等に広げます。レジンを充填した胆管の末端枝(野生型マウス)は、肝臓の表面にかすかに見えます
    手記：肝臓を満たすための予想時間は30-100秒です。
15. レジンの点が肝臓の表面に現れたとき(図2Ci、青い矢印)、または抵抗が満たされたときは、レジンの注入を停止します
    手記：レジン硬化剤を添加するとレジンが固まり始めますので、なるべく早く作業してください。硬化剤の添加による作業時間は約15分です。
16. チューブを総胆管から引き抜いて取り外し、鉗子を使用してシルクノットをすばやく締めて、樹脂が漏れないようにします。絹の縫合糸の緩い端を切り取り、門脈の注入を妨げないようにします。
17. レジンが入ったチューブと残りのレジンは有害廃棄物に、針は鋭利物廃棄物に捨ててください。

結果

図1:レジンキャスト用インジェクションセット(A)インジェクションセット#1は、30Gの針と~30cmの長さのPE10チューブで構成されています。インジェクションセット #2 は、23 G の針と ~30 cm の長さの PE50 チューブで構成されています。(B)チューブの先端を伸ばして斜めにカットし、先端を斜めにします。AとBの定規はセンチメートルの定規で、大小刻みが1cm、中間刻みが5mm、小刻みが1mmです。

図2:ダブルレジンキャストフロー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL SafeSeal マイクロチューブ	ザルシュテット	72.706
チューブ付き23Gバタフライニードル	BDバイオサイエンス	367283
23G針	BDバイオサイエンス	305892
30Gの針	BDバイオサイエンス	305106
アガロース	トップバイオ	P045
ベンジルアルコール	シグマ・アルドリッチ	108006
安息香酸ベンジル	シグマ・アルドリッチ	B6630
コーニング 50 mL チューブ	シグマ・アルドリッチ	CLS430829-500EA	ポリプロピレン
綿棒	メディカリア	60406
解剖顕微鏡	ライカカメラAG	ライカM60
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190144
エタノール 70%	VWRの	83801.41
ファルコンチューブ15 mL	ヴェルコン	331.850.084.006
湾曲した鉗子	ファインサイエンスツール	11051から10	ファイングレーフ10cm湾曲
鉗子ストレート	ファインサイエンスツール	11050から10	ファイングレーフ 10 cm ストレート
ホルムアルデヒド溶液	シグマ・アルドリッチ	F8775
ハンクスのバランスの取れた塩溶液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14025092
ヘパリン	レオファーマ	B01AB01	5000 IE/mL
イソルフラネ	バクスター	FDG9623
メタノール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11413413
マイクロフィル	フローテック	MV-122	合成樹脂 イエロー
マイクロフィル	フローテック	MV-120	合成樹脂 ブルー
マイクロフィル	フローテック	MV希釈剤	透明樹脂希釈剤
パスツールピペット	ヴェルコン	130.690.424.503
蠕動ポンプ	アグントス	010.6131.M20
ロッカー	VWRの	〒444-0142
シルク縫合糸	アグントス	14757	ブラックシルク、4-0、滅菌、100 m
スキンシザー	ファインサイエンスツール	14058から09	アイリスストレートチップ9cm
スプリングシザー	ファインサイエンスツール	15000から03	Vannas micro、ストレートチップ 2 mm
シリンジ 1 mL ルアー	BDバイオサイエンス	303172
チューブ PE10	BDバイオサイエンス	427401
チューブ PE50	BDバイオサイエンス	427411