マウスモデルからの洞房結節分離:マウス心臓からSA結節を採取する手順

要約

出典:Kumar, P et al., Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、マウスの心臓から洞房結節またはSANを分離する手順を示しています。SANは、自発的な活動電位を生成することによって心拍を開始する洞房細胞を収容します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 洞房結節(SAN)の解剖

1. ヘパリン処理されたComplete Tyrodeの溶液をSAN解剖用に調製します。
   1. 400 μLのヘパリン(1,000 USP/mL)を40 mLの完全タイロード溶液に加え、37°Cのウォーターバスで温めます。
2. マウスに200〜300μLのヘパリン(1000 USP / mL)を腹腔内に注入し、動物を10分間座
らせます。
3. ヘパリン化されたマウスをイソフルランの過剰摂取によって安楽死させます。.
   1. 穴あきプラスチックチューブ内の濾紙に200〜300μLの液体イソフルランを加えることによって生成されるイソフルラン蒸気を含む小さなガラスチャンバーにマウスを置きます><。 注:イソフルランは皮膚の炎症を引き起こす可能性があり、皮膚からも吸収される可能性があるため、液体がマウスに直接接触しないようにしてください。したがって、イソフルランを浸したワイプを穿孔チューブに入れて投与する。
   2. 動きと呼吸の努力の停止、およびつま先のつま先つまみ反射の欠如による死を確認します。通常、チャンバーに埋入されてから約1〜2分で死亡します
      手記：死は通常、排尿を伴います。
4. 前足を伸ばした状態でマウスを解剖ボード上の仰臥位に置き、長さ1インチの23ゲージの注射針を使用して前足をボードに固定します。次に、手術用ハサミを使用して胸郭の底付近の毛皮を取り除き、根元の毛皮を切ります
   手記：解剖ボードには、ポリスチレンクーラーの蓋を使用することができます。
5. 止血器で皮膚を保持しながら、手術用ハサミを使用して、胸郭の底のすぐ下の皮膚を左肋骨弓から右肋骨弓まで横切開します(図1A)。
6. 手術用ハサミで腹膜を切り開き、肝臓を傷つけないように注意しながら、肝臓を横隔膜から慎重に分離します。これにより、過度の出血を引き起こします(図1B)。胸部に沿って横隔膜を切開して、胸腔を露出させます(図1C-D)。
7. 手術用ハサミを使用して、胸郭の側壁を肋骨弓の端から鎖骨まで切断して心臓を露出させ、心臓を損傷しないように注意します(図1D)。次に、23ゲージのシリンジ針を使用して胸郭を肩に固定し、手術野の邪魔にならないように所定の位置に保持します。
8. トランスファーピペットを使用して、温かく(37°C)ヘパリン化されたComplete Tyrodeの溶液を心臓に滴下し、心臓を湿らせます
   手記：心臓が乾かないようにしてください。
9. 極細のGraefe鉗子で肺を保持し、手術用ハサミで気管を切断して肺を切除します(図1E)。
10. 極細のグレーフ鉗子で心臓の頂点を保持し、手術用ハサミで大動脈と大静脈を切って取り除きます。硬化シリコーンエラストマー(図2A)を含むシャーレに心臓を移し、トランスファーピペットを使用して、2〜3 mLの温かい(37°C)ヘパリン処理された完全なタイロード溶液で心臓を浸します。
    手記：SANを含む右心房の繊細な後壁と、接続された右心房静脈を傷つけないように注意してください。コンプリートタイロードの溶液で心臓を入浴させると、心臓が乾燥するのを防ぎますが、解剖中の視界を損なうため、心臓を完全に溶液に浸さないでください。
11. 実験者の右側に右心房、実験者の左側に左心房を向けます。
    手記：虚血関連の損傷を防ぐために、SAN組織の解剖を迅速に行う必要があります。
12. ハートの頂点を解剖ピンで皿に取り付けます。次に、Dumont #2椎弓切除鉗子で下大静脈を保持しながら、下大静脈と上大静脈に22Gのシリンジ針を挿入して、右心房の位置を特定します。これにより、SANのおおよその位置(下大静脈と上大静脈の間の組織のパッチにあります)も特定されます(図2B)。
13. 小さな解剖ピンを使用して、左右の心房付属器を皿に固定します。
    1. デュモン#2椎弓切除鉗子で左心耳を保持しながら、左心耳に解剖ピンを通して所定の位置に保持します。
    2. デュモン#55鉗子で右心房付属器を保持しながら、右心房付属器に解剖ピンを通して所定の位置に保持します。
       手記：必要に応じて、同じタイプの鉗子を使用して左右の心房付属器を保持することができます。
14. 大静脈にまたがるシリンジ針を取り外します。
15. 心臓から血液を放出するには、Castroviejoはさみを使用して、心室を横切開することにより、心臓の頂点(つまり、下半分)を取り除きます(図2C)。次に、温かい(37°C)ヘパリン処理したComplete Tyrode溶液をトランスファーピペットで加えて心臓を洗浄します。
16. Castroviejoはさみを使用して、房室中隔に沿って切開し、切開部を心房よりも心室に近づけます。心房が心室から分離されるまで、房室中隔に沿って切断を続けます。
17. 心房中隔に沿って切断し、左心房を切除します。
18. 右心房の周囲に解剖ピンを配置して、平らに置きます(図2D)。Castroviejoはさみを使用して、心房から残っている脂肪、血管、または組織をすべて取り除きます。
19. SAN を右心房に配置します。この方向では、上大静脈 (上)、下大静脈 (下)、およびクリスタエ ターミナル (左側) にほぼ隣接しています (図 2D).
    注:クリスタ終末は、右心房付属器とSANの間の暗い筋肉の隆起として現れます。多くの場合、SAN動脈はSANを通って流れているのも確認できます(図2D)。

結果

図1:心臓の除去。(A)胸郭の底部のすぐ下の皮膚の左肋骨弓付近から右肋骨弓までの横切開。(C、D) 胸部に沿って横隔膜を切開して、胸腔を露出させます。(E)肺の切除後の心臓の除去。

図2:洞房(SAN)結節の解剖。(A)体から取り出した後のペトリ皿内の心臓の外観。(B)右心房の下大静脈(IVC)お...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
22ゲージシリンジニードル	フィッシャーサイエンティフィック	14-826-5A	解剖に使用
23ゲージシリンジニードル	フィッシャーサイエンティフィック	14-826-6C	解剖に使用
60mmペトリ皿	ジェネシー・サイエンティフィック	32〜105グラム
Castroviejoはさみ、4インチ	ファインサイエンスツール	15024-10
解剖顕微鏡	ジェンコ
ピンの解剖	ファインサイエンスツール	26002-20
デュモン#2椎弓切除鉗子	ファインサイエンスツール	11223から20
デュモン #55 鉗子	ファインサイエンスツール	11295から51
エクストラファイングレーフ鉗子	ファインサイエンスツール	11152から10
止血	ファインサイエンスツール	13013-14
ヘパリン	Aurobindo Pharma Limited IDA、パシャミララム	NDCの63739-953-25
シルグリュアールエラストマーキット	ダウコーニング	184 SIL エラストキット 0.5KG
手術用ハサミ	ファインサイエンスツール	14074から09
トランスファーピペット(3mL目盛り付き)	サムコサイエンティフィック	225
イソフルラン	パターソン獣医	07-893-1389

名 (代表)