マウスモデルにおける持続薬物注入システム:連続薬物送達のためのマウス脳に微小浸透圧ポンプ注入システムを移植する外科的処置

要約

出典: Ajoy, R., Chou, S. Y. Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、微小浸透圧ポンプ脳注入システムの組み立てと、それに続くマウスの頭蓋骨への外科的移植を実演します。このシステムは、潜在的な薬物の継続的な送達を可能にし、脳および脳組織への影響の研究を容易にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 微小浸透圧ポンプ輸液システムの準備

>注:0.2 μmフィルターでろ過したバッファーを使用して、ポンプ、人工脳脊髄液(aCSF)バッファー、および薬物(Met-CCL5/RANTESタンパク質溶液(10 ng/mL in aCSF))を滅菌条件下で調製し、すべての手順を培養フードの下で手袋を着用して行ってください。手術手順は次のように行われます。

1. 手術の1日前に微小浸透圧ポンプを準備します:キットに付属の1mLの注射器と鈍頭針を使用して、脳の微小浸透圧ポンプに人工脳脊髄液(aCSF)を満たします。微小浸透圧ポンプをaCSFに浸し、シェーカーに置き、一晩静かに振とうします
   注意: ポンプにはaCSFを充填し、ポンプ内部に気泡が入らないようにする必要があります(図1A)。
2. 手術を開始する前に、実験で使用する組換えMet-CCL5/RANTESタンパク質溶液(10 ng/mL、aCSFで希釈したもの)を調製します。ポンプからaCSFを取り出し、余分なものが漏れるまでゆっくりとポンプに薬液を入れます
   注:5〜8台のポンプには、15mLのaCSFまたはMet-CCL5/RANTES溶液で十分です
   注意: 手順を繰り返して、ポンプが内部に気泡がなく、薬物で完全に満たされていることを確認します。.
3. カテーテルチューブを希望の長さに切断し、脳注入キットの鈍端脳注入針で取り付けます。輸液キットとチューブに薬を入れます。
4. 最後に、脳輸液キットを組み立てて微小浸透圧ポンプに取り付けます.
   注意: チューブやポンプに気泡が発生しないようにしてください(図1A)。
5. aCSFにセットした浸透圧ポンプ-脳融合体全体を滅菌した50mLチューブに浸し、ポンプの乾燥を防ぎます。浸透圧ポンプと脳の融合セットは、手術に使用する準備が整いました.
   注:微小浸透圧ポンプシステムは、長期の薬物注入に使用できます。これにより、マウスの脳への安全で便利な薬物送達が可能になります。

2. 脳内心室手術 – 微小浸透圧ポンプの埋め込み

>注意:手術環境を75%エタノールで滅菌し、研究に関与する人々が滅菌手袋と清潔な白衣を着用していることを確認してください。手術器具/器具は、使用前にオートクレーブ滅菌して乾燥させ、その後、マウスの手術の合間に75%エタノールで滅菌する必要があります。

1. マウスの体重を量り、ケタミン/キシラジン(ケタミン50 mg / kg、キシラジン10 mg / kg).
   注意:マウスの体重が24 g未満のマウスは、浸透圧ポンプ移植手術には推奨されません。
2. マウスヘッドを定位装置に取り付けて固定します(図1B)。
3. 外科用ハサミとペンチを使用して、頭蓋骨を覆っている外側の皮膚を切り開きます。ヨウ素を使用して、周囲の頭蓋骨を清掃します。
4. 浸透圧ポンプ脳融合セットの移植のために、首の領域近くの一対の鈍い頭のはさみの助けを借りて、皮膚の最外層を皮下皮膚から分離します(図1C)。
5. 定位装置を使用して、脳マップ(図1D)を参照して注入ポイントをマークします。この実験では、針を第 3 心室領域 (Bregma: 横方向 0.0 mm、後方 1.3 mm、腹側 5.7 mm) に埋め込む必要があります。
6. 頭蓋骨にマークされた領域の周りにネイルドリルを使用して穴を開けます(図1E).
   注意:マウスの髄膜や血管を壊さないように注意して、脳内の微小血管の破壊を避けてください。
7. aCSF(コントロールとして)または薬物(Met-CCL5/RANTESタンパク質溶液)を含む微小浸透圧ポンプ-脳融合セットを頸部の後ろの皮膚の下に置き、ドリルで開けた穴に脳注入針を挿入して、マウスの脳に薬物を注入します(図1E)。針は髄膜を貫通し、心室に入ります。表面減感作ジェル(図1F)を使用して針を頭蓋骨の所定の位置に固定し、接着剤が乾くまで1〜2分待ちます。次に、針の上の突出部を切り取ります(図1G-H)。
8. ティッシュ接着剤を使用して、頭の手術傷を癒します。傷口の上に50μLの接着剤を塗布し、皮膚の両側を一緒に引っ張り、皮膚が密閉されるまで30秒間保持します(図1I).
   注意:手術後の傷口の清掃には100%アルコールパッドを使用し、感染を防ぐためにストレプトマイシンと100μlのペニシリンを使用します。注:マウスの皮膚は瘢痕組織を形成し、手術用接着剤の投与後数日で治癒します。接着剤の主な利点は、皮膚の炎症や炎症を引き起こす可能性のある外科的ステッチを回避できることです。
9. マウスを温かいプレート(37°Cまで加熱)に保たれた清潔なケージに入れ、マウスが麻酔効果から回復するまで待ちます
   注意:手術後の生存率を高めるためには、マウスの体温を維持することが重要です。
10. 1週間の回復期間の後、マウスは経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)やインスリン負荷試験(ITT)などのさらなる実験の準備が整います。

結果

図 1.マウスにおける浸透圧ポンプの調製と移植手術。(A)薬物溶液で灌流した脳輸液キットおよびポンプ調製物。赤い矢印は、液体で満たされたカテーテルチューブを示しています。(B)マウスヘッドを定位固定装置に固定して取り付けます。(C)微小浸透圧ポンプ脳注入セットの移植のために、皮膚の最外層を皮下皮膚から分離します。破線は浸透圧ポンプインプラントの位置を示します。(D)矢印は輸液側を示しています。(E)頭蓋骨のマークされた領域の周りに穴を開けます。(F)浸透圧ポンプ脳注入セットをマウスの背部に置き、ドリルで囲んだ穴(破線の丸で囲った部分)に脳注入針を差し込む。(G) 組織接着接着剤を使用して針を頭蓋...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Vetbondティッシュ接着剤	3メートル	#1049SB	マウスの頭部の病変部位をシールするために使用される接着剤
LOCTITE 454インスタント接着剤	株式会社デュレクト	#8670	マウスの頭蓋骨に針を固定するために使用した接着剤
Alzetマイクロ浸透圧ポンプ	株式会社デュレクト	#9922	0.11 μl/時間、28日間
脳輸液システム	株式会社デュレクト	#8851	1〜3 mm、マウスの脳に薬物を灌流するために使用されます
MIO NE116 コントロールユニット(ネイルドリル)	Mioシステム	#E235-015	マウスの頭蓋骨に穴を開けるには
aCSFフォーミュラ	119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM グルコース		0.22μmのフィルター装置でフィルター滅菌し、4°Cで保存します。