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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. マウスの作製と頸静脈へのカテーテル挿入
>注:ここでは、雄または雌の5-7週齢のmTmGレポーターマウス(B6.129(Cg)Gt(ROSA)26Sortm4(ACTBtdTomato,-EGFP)Luo10)をPf4-creマウスと交配し、巨核球および血小板における強力な緑色蛍光標識を可能にしました。実験を開始する前に、顕微鏡の加熱チャンバーを数時間予熱します。
- マウスをイメージングルームに運び、麻酔に進みます。
- ケタミン (ケタミン (100 μg/g) とキシラジン (10 μg/g) (5 μL/g) の溶液の腹腔内 (i.p.) 注射によりマウスに麻酔をかけます
手記：ここではケタミン/キシラジンの反復投与が使用され、うまく機能しますが、定期的な再注射のために記録を中断する必要があります。あるいは、麻酔器が利用可能な場合、麻酔の導入はケタミン/キシラジンで行われ、その後、ガス(イソフルラン、空気、および酸素の混合物)の吸入下で維持される場合があります。
- 動物が深い麻酔に達するまでケージに入れ替えます。マウスを37°Cで温めた加熱プレートの上に置き、その後のすべての操作を行います
手記：動物が深い麻酔に達している間に、顕微鏡とすべての機器のスイッチを入れ、手術が完了したら実験を開始するために必要なさまざまなパラメーターを設定します。ここでは、手順はわずか3時間続き、終末期です。マウスは実験後、目を覚ますことなく安楽死させます。したがって、皮膚や器具のエタノール消毒で十分です。ただし、施設のガイドラインによっては、または手順が長引く場合は、ベタジン/ポビドンとアルコールを交互に3回スクラブするなど、より完全な消毒方法を使用する必要があります。
2. 頸静脈にカテーテルを留置します。
>注:手術中の微生物汚染を可能な限り避けることが重要です。手術を進める前に、70%エタノール(EtOH)で皮膚を丁寧に消毒するように注意してください。常に滅菌済みのハサミとピンセットを使用し、定期的に70%EtOHですすいでください。清潔な場所で作業し、フェイスマスクを着用してください。静脈内注射には、プラスチックチューブ内の針からなる22Gの「オーバーザニードル」カテーテルが使用されます(材料の表を参照)。
- マウスを仰向けに置き、前脚をサージカルテープで固定して喉を伸ばします(図1A)。70%エタノールで喉を消毒します.
手記：便宜上、手術前に喉を剃ることがあります。手順が長引く場合は、適切な無菌技術のために慎重なシェービングを行う必要があります。
- 滅菌ハサミを使用して、右または左の頸静脈に0.7〜1cmの切開を行います。隣接する結合組織を伸ばして、外頸静脈と胸筋の上部を露出させます(図1A)。
- カテーテルに温かく滅菌した生理食塩水を入れます。胸筋を貫通した後、カテーテルを静脈に挿入します(図1B).
手記：カテーテル内に気泡が入らないように注意してください。筋肉が圧迫点を形成するため、出血を防ぐためにカテーテルを筋肉に挿入することが重要です。Itgb3-/-マウスのような止血欠損のあるマウスでも、このアプローチではカテーテル挿入時に出血しません。
- 針をそっと取り外し、必要に応じてカテーテルを静脈の奥深くまで慎重に動かします。シリンジを接続し、外科用接着剤(Table of Materials)を一滴追加してカテーテルを安定させます
手記：尾静脈の内側にカテーテルを挿入することは可能ですが、静脈の口径が小さいため、ある程度の練習が必要です。これは、尾静脈がほとんど見えない黒髪のマウスを使用する場合に特に困難です。カテーテルは口径が大きいため、カテーテルを頸静脈内に配置することで、より多くの量や繰り返しの治療をより確実に注入できる可能性があります。シリンジは最初に温かい生理食塩水で満たされることに注意してください、そして薬液を注入する前にデッドボリュームを注入することを忘れないでください。
- マウスを慎重に腹臥位に戻します(図1C)。乾燥を防ぐために、目にジェル(Table of Materials)を塗ります。
