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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
>1. 頭蓋リングの手術と装着
>注:マウスの取り付けを完全にサポートするには、ブロックとプレート、マウスヘッドを保持するリング、およびリングをブロックに固定するためのネジの4つが含まれます(図1A)。サポートのすべての要素は、3Dプリントによる i.materialise.com から取得されています。プレートはアクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)ポリマー、ステンレス鋼のブロックとネジ、および高級ステンレス鋼(高詳細ステンレス鋼)のリングでできています(3D印刷ファイルの寸法と材料については、図2を参照してください)。ブロックは、ねじ込みまたは接着されて、サポートに恒久的に固定されます。リングをマウスの頭蓋骨に固定したら、ブロックホルダーにねじ込む必要があります(図1A)。
- 70%エタノールを濡らしたペーパータオルで頭皮の髪を湿らせて消毒します。濡れたペーパータオルで抜け毛を全て取り除きます
手記：便宜上、手術前に頭皮を剃ることもあります。
- 頭皮を切開し、正中線に最大1cmまでT字型を形成し、耳の間に頭蓋骨を露出させます。滅菌済みの細いハサミとピンセットを使用します
手記：リングは、前頭骨と頭頂骨に重なるように配置されます (図 1B)。
- 滅菌ピンセットを使用して頭蓋骨を露出させます。ハサミとピンセットで骨膜を慎重に取り除きます。生理食塩水に浸した滅菌綿棒を使用して、すべての骨膜と、画像を変更する可能性のある破片や髪の毛を取り除きます
手記：炎症反応を抑えるためには、骨を傷つけないように細心の注意を払ってください。
- 生理食塩水ですすいで血痕を取り除き、乾いた綿棒で骨をすばやく乾かします。グルージェルをリングに塗布し、露出した骨の上に置き、リングが頭蓋骨にしっかりと取り付けられるように数秒間保持します
手記：接着剤は、望ましくない自家蛍光につながる可能性があるため、観察フィールドに入ってはいけません。
- 生理食塩水に浸した綿棒で頭蓋骨を軽く湿らせます。
- シリコンデンタルペーストは、青と黄色の成分を1:1で慎重に混合して調製します。イメージング中の漏れを防ぐために、シーリングのためにリング全体にデンタルペーストを塗布します。リングに入った可能性のあるデンタルペーストや接着剤を慎重に取り除きます。
- リングに生理食塩水を入れ、漏れがないか確認します。
手記：生理食塩水は、顕微鏡対物レンズの液浸媒体として機能します。止血関連の欠陥を持つマウスを使用する場合、出血はより重大になる可能性があります。血液がリングに入るのを防ぐことは、さらなるイメージングをぼかす可能性があるため、不可欠です。
- マウスをサポートに置き、リングをブロックホルダーにねじ込みます(図1C)。折りたたんだ湿布を動物の頭の下に置き、頭を持ち上げ、頭蓋骨からリングが外れないようにします。
手記：呼吸による画像の動きを防ぐため、頭部を直接固定しています。
- サポートとマウスアセンブリを加熱された顕微鏡チャンバー(図1D)に配置します
注意: 挿入したカテーテルが外れないように注意してください。
