生体内イメージング:安定化イメージングウィンドウによるマウス膵臓の細胞レベル観察法

Abstract

出典: Park, I. and Kim, P. Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、細胞ダイナミクスの長期的な視覚化のために、安定化された窓を通してマウスの膵臓の生体内イメージングについて説明します。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 生体内イメージング

1. レーザー出力を含む生体内顕微鏡の電源を入れます。
2. 加熱パッドをオンにし、恒温調節を37°C.
   に設定します 手記：または、パッシブ加熱パッドまたはlを使用しますamp 恒温性調節がない場合は、頻繁に制御します。
3. 膵臓窓が事前に埋め込まれたマウスを服用します。チレタミン/ゾラゼパム (30 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の混合物で筋肉内麻酔を行います.
   手記：高血糖の悪影響があるため、ケタミンの代わりにチレタミン/ゾラゼパムの使用をお勧めします。.実験の目的のために最適な麻酔を選択する必要があります。
4. 注射用の血管カテーテルを挿入します。
   1. 止血帯の代わりに、人差し指と薬指で尾の近位側に圧力をかけます。必要に応じてランプでテールを加熱します。
   2. 尾静脈を70%エタノールスプレーで滅菌します。
   3. 30Gのカテーテルを外側尾静脈に挿入します。血液の逆流は、PE10 チューブで視覚化されます。
   4. カテーテルにシルクテープを貼って安定させます。
   5. 蛍光プローブの組み合わせに応じて、必要に応じてFITC/TMRデキストランまたは他の蛍光プローブ(Alexa 647と結合した抗CD312 25 μg)を注入します
      手記：蛍光標識抗体プローブの場合は、イメージングセッションの2時間前に注入してください。
5. マウスを手術台からイメージングステージに移します。
6. 直腸プローブを挿入して、ホメオサームヒーティングパッドシステムで体温を自動的に制御します。
7. 膵臓イメージングウィンドウを、生体内顕微鏡のセットアップ中に準備したウィンドウホルダーに挿入します(図1)。倒立顕微鏡の場合、ウィンドウホルダーは必要ないかもしれません。
8. 生体内イメージングを行います。
   1. 膵臓をイメージングするには、膵臓イメージングウィンドウで膵臓の全体像をスキャンするための低倍率対物レンズ(例:4倍)から始めます(推奨視野:2500 x 2500 μm)。
   2. 関心領域を決定したら、高倍率の対物レンズ(20倍または40倍)に切り替えて、細胞レベルのイメージングを行います(推奨視野:500 x 500 μmまたは250 x 250 μm)。この実験では、横方向と軸方向の分解能はそれぞれ約0.5μmと3μmでした。
   3. zスタックイメージングまたはタイムラプスイメージングを実行して、細胞遊走などの3D構造または細胞レベルのダイナミクスを観察します.
      手記：トランスジェニック動物の蛍光タンパク質発現細胞(MIP-GFP)のイメージングでは、最大0.43 mWの出力で30秒間の断続的な488 nmレーザー曝露は、目立った光退色や組織損傷なしに許容されました。Alexa 647で標識した蛍光タンパク質のイメージングでは、最大0.17 mWの640 nmレーザー出力は、目立った光退色や組織損傷なしに許容できました。この設定を超える出力で長時間励起レーザーを照射すると、光毒性による光退色や組織損傷を引き起こす可能性があります。適切なゲインと電力を調整して、関心領域を適切に画像化します。生体内顕微鏡のパラメータの詳細な設定は、研究所で準備された生体内顕微鏡ごとに個別化する必要があります。

Results

図1:膵臓生体内イメージングウィンドウの実施の写真。膵臓の生体内イメージングウィンドウをXYZ並進期のマウスに埋め込み、傾斜マウントに取り付けられたイメージングチャンバーホルダーを膵臓イメージングウィンドウに接続します。Copyright 2020 韓国糖尿病協会 from Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198.韓国糖尿病協会の許可を得て転載。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 スクシンイミジルエステル (NHS エステル)	インビトゲン	A20006	抗体標識用蛍光プローブ
BDイントラメディックポリエチレンチューブ	BDバイオサイエンス	427401	針との接続のためのPE10カテーテル
C57BL/6N	オリエントバイオ	C57BL/6N	C57BL/6N
カバーガラス円形	マリエンフェルド	0111520	膵臓イメージングウィンドウ用カバーガラス
FITC デキストラン 2MDa	メルク(旧シグマ・アルドリッチ)	FD200Sの	船舶識別用
イマリス 8.1	ビットプレーン	イマリス	画像処理
生体内顕微鏡検査	IVIM技術	IVM-Cの	生体内顕微鏡検査
MIP-GFPの	ジャクソン研究所	006864	B6です。CG-TG(INS1-EGFP)1原/J
膵臓イメージングウィンドウ	Geumtoエンジニアリング	カスタムオーダー	膵臓イメージングウィンドウ - カスタムオーダー
フィジオスイート	ケントサイエンティフィック	PS-02	恒温温度コントローラー
TMRデキストラン 65-85kDa	メルク(旧シグマ・アルドリッチ)	T1162	船舶識別用
ウィンドウホルダー	Geumtoエンジニアリング	カスタムオーダー	ウィンドウホルダー - カスタムオーダー
ゾレチル	ビルバック	ゾレチル100	麻酔薬
ロンプン	バイエル	ロンプン	麻酔薬