順行性灌流モデル:単離されたマウス心臓を灌流するためのEx Vivo技術

要約

出典:Omatsu-Kanbe, M. et al., An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、孤立したマウスの心臓の順行性灌流技術について説明しています。その間に灌流液が左心室から注入され、最終的に心筋全体に灌流されます。この方法は、マウスモデルから心筋細胞を単離し、さらなるダウンストリームアプリケーションのための脱細胞化心臓を生成するために使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. マウスの心臓の順行性灌流

>注:心臓を吸引するために使用されるプラスチック製の移送ピペットは柔らかく、先端に向かって急激に先細りにならないようにする必要があります。セレーション付きの小さな血管クランプを選択してください。推奨される機器は、資料の表に記載されています。

1. マウスの心臓の切除と大動脈のクランプ
   手記：成体マウス(>8週齢)は、ペントバルビタールナトリウム(>300 mg / kg、腹腔内[i.p]注射)とヘパリン(8000 unit / kg)の過剰投与によって安楽死させる必要があります。.
   1. 吸うことでマウスの心臓をすばやく切除します。
      1. 胸腔をすばやく開いて心臓を露出させます。先端が露出した心臓とほぼ同じか、それよりわずかに小さいプラスチック製のトランスファーピペットをカットします(通常は0.5mLのマークから先端に向かって約1cmの場所にありますが、心臓のサイズによって異なります)。
      2. 心臓をピペットに吸い込み、ピペットを上げてハサミを挿入するのに十分なスペースを作り、背側から湾曲したハサミで心臓を切除し、心房を傷つけないようにします。
      3. 切除した心臓を氷冷したCIB-EGTAが入った30mLのガラスビーカーに直ちに移し、収縮を止めます。この手順には通常<1分かかります。
   2. 大動脈周りの清掃
      1. 氷冷したCIB-EGTAを充填した35mm培養皿に心臓を移し、肺などの目に見える組織を切除した後、粗く洗浄した心臓を冷やしたCIB-EGTAを充填したハートスタンドに移し、頂点を下にして置きます。
      2. 実体顕微鏡で脂肪と結合組織を取り除き、大動脈の周囲を清掃します。切開した大動脈の長さが腕頭動脈、左総頸動脈、左鎖骨下動脈などと長すぎる場合は、腕頭動脈のすぐ下の大動脈を切開して短くし、次のステップに進みます。この手順は通常約4分かかります
   3. 大動脈をクランプし、クランプされた心臓を灌流プレート上に置く
      1. 注射針を挿入し、灌流を開始して血液を排出します
         1. 顕微鏡で、心臓をハートスタンドに置きます。オペレーターは心臓の前面を向き、ピンセットで大動脈の端をつまみ、大動脈を少し優しく押し下げながら、小さな血管クランプで心房近くの大動脈をクランプする必要があります。
         2. クランプした心臓を灌流プレートに置き、前面を上にして数滴のCIB-EGTAで覆います。この手順には通常 <20 秒かかります。
      2. 心臓の順行性灌流
         手記：まず、CIB-EGTAで心臓を灌流して血液を排出し、凝固を防ぎます。
         1. 注射針を挿入し、灌流を開始して血液を排出します
            1. 温めたCIB-EGTAを充填した20mLシリンジをフレキシブルエクステンションチューブに接続し、印付きの注射針を輸液ポンプにセットします。0.5 mL/minの低速でポンプを始動し、針とチューブにCIB-EGTAを慎重に充填し、チューブに空気が入らないように注意してください。
            2. 灌流プレートに注入針を置き、斜め形状の短辺を前にして置きます。針を心臓の頂点に向かってスライドさせて接触し、次に左心室の頂点付近に針をねじらずに慎重に心室に挿入します。挿入中は、針をプレートから取り外さないでください。
            3. 赤いマークを見て、針の挿入の深さを推定します。針の挿入が完了すると、冠状動脈から流れる血液が排出され始めるはずです。
            4. 注入針をプレートにテープで固定し、ポンプ速度を1mL/minに上げます。この手順には通常、約 30 秒かかります。心臓の灌流に成功した場合、心外膜のすぐ下の毛細血管内のCIB-EGTAの流れを顕微鏡で見ることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
延長チューブ	Top, 日本	X1-50	シリンジと注射針で接続して、順行性灌流を行います。
ヒーターマット	夏目製作所、日本	KN-475-3-40	灌流プレートを温める装置。
輸液ポンプ	TERUMO, 日本	TE-311	順行性灌流用の輸液シリンジポンプ。
注射針(27ゲージ)	TERUMO, 日本	NN-2719Sの	左心室に挿入するための針。
インスリン(ウシ膵臓由来)	Sigma-Aldrich, アメリカ	I5500	0.1 M HClに溶解します。
プラスチックシリンジ(20mL)	TERUMO, 日本	SS-20ES	CIB-EGTAの注入に使用します。
血管クランプ	Karl Hammacher GmbH、 ドイツ	HSE 004-35	大動脈のクランプに使用される小さなまっすぐな血管クランプ。
他のすべての試薬	ナカライ・テスク(日本)

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