出典: Liu, Y., et al. Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve. J. Vis. Exp. (2021)
このビデオでは、灌流加圧によりマウスの肺値を閉鎖型コンフォメーションで分離し、化学的に固定する手順を説明します。
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方法論記事
単離されたマウス肺動脈弁の圧力固定:マウス肺動脈弁を閉鎖構造で分離して化学的に固定する手順
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 肺動脈弁切除術
- マウスの解剖に必要なツールをオートクレーブします。これには、細いハサミ、マイクロ鉗子、マイクロ血管クランプ、クランプ適用鉗子、マイクロニードルホルダー、スプリングハサミ、リトラクターが含まれます。
- 手術の少なくとも2週間前にすべてのマウスを順応させます。約1歳齢のC57BL / 6マウスをケージから取り出して体重を量った後、ケタミン/キシラジンカクテル(3:1ケタミン:キシラジン、1gあたり0.01 mL)の過剰摂取で安楽死させます。.
- マウスをトレイの背側横臥位に置き、手足をテープで固定します。固定したら、開胸術を行います。
- 余分な脂肪組織と筋膜を取り除き、心臓を露出させます。
- 右心房を取り外し、室温の生理食塩水(0.9%NaCl)で左心室から灌流します。.灌流は30秒で約20mLかかります。これにより、マウスの放血が発生します。
- 上大静脈、下大静脈、肺動脈、大動脈を切断して心臓全体を切除します。肺動脈には特別な注意を払う必要があります。心室-動脈接合部の約2mm上に切断します、これは加圧のための導管として機能するからです。
- 左右の心室を取り外して、チャンバーを大気圧にさらします。肺動脈幹の構造が心室の除去によって影響を受けないようにしてください。
2. 肺動脈弁の圧力固定
- 肺動脈と吻合する加圧チューブで、副鼻腔と管状接合部とチューブの端との間に約1mmの距離を残して、弁尖と肺幹の大きな動きに対応します。
- リザーバーを類似の生理学的圧力まで上昇させ、生理食塩水で満たします。フロースルーシステムをテストして、詰まりや気泡がないことを確認します。
- 吻合した肺動脈弁にストップコックを取り付け、流出路を切り替えてチューブを通る適切な流れを確保します(つまり、気泡が発生しないようにします)。流れが適切になったら、流出を吻合した肺動脈弁に切り替え、肺体幹の加圧を確保します。これは、肺幹膨満によって識別されます。
- 肺動脈幹の加圧を確認したら、生理食塩水がパージされるまで、一次固定液(1.25%グルタルアルデヒド、1.0%パラホルムアルデヒド、0.15 Mカコジル酸)を徐々に混ぜます。.これは、生理食塩水のリザーバー容量の約25%の一部を取り除き、それを一次固定液に置き換えることによって行われます
注意：使用される固定剤(パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド)は非常に毒性が高く、安全性を確保するために適切な個人用保護具(PPE)を着用する必要があります。 - 固定剤を染み込ませたガーゼを組織サンプルにかぶせて乾燥を防ぎます。
- 固定剤を3時間灌流し、必要に応じてリザーバーを補充して一定の圧力を維持します。固定中、化学的固定のために肺動脈弁が収縮することは珍しくありません。その場合は、リザーバーに一次固定液を常に補充して、生理的圧力を維持してください。
- 心臓弁は、使用するまで4°Cの固定液で保存してください。サンプルは最大1週間保存されましたが、識別可能な違いはありませんでした。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 25% グルタルアルデヒド (AQ) | EMSの | 16210 | 主な固定成分 |
| 0.9%塩化ナトリウム注射 | ホスピーラ株式会社 | NDC番号 0409-4888-10 | |
| 1 mLシリンジ | BDの | 309659 | |
| 10 mLシリンジ | BDの | 309604 | |
| 22Gニードル | BDの | 305156 | |
| 3方向ストップコック | スミスメディカルASD株式会社 | MX5311L | |
| 4% パラホルムアルデヒド (AQ) | EMSの | 157*4*100 | 主な固定成分 |
| C57BL/6マウス | ジャクソン研究所 | 664 | 約1歳 |
| 鉗子を適用するクランプ | FSTの | 00072から14 | |
| デュモン#5鉗子 | FSTの | 11251から20 | |
| デュモン#5/45鉗子 | FSTの | 11251から35 | |
| デュモン#7ファインフォーセプ | FSTの | 11274から20 | |
| 細いハサミ | FSTの | 14028から10 | |
| 生理食塩水(滅菌0.9%塩化ナトリウム) | ホスピーラ株式会社 | NDC番号 0409-0138-22 | |
| 手術用顕微鏡 | ライカ | M80 | |
| ティッシュニードルホルダー/鉗子 | ミクリンス | MI1540 | |
| トリマー | ヴァール | 9854-500 | |
| ブラックポリアミドモノフィラメント縫合糸、10-0 | AROSurgicalインスツルメンツ株式会社 | TI38402 | |
| ブラックポリアミドモノフィラメント縫合糸、6-0 | AROSurgicalインスツルメンツ株式会社 | SN-1956 | |
| 塩酸ケタミン注射 | ホスピーラ株式会社 | NDC番号 0409-2053 | |
| L-アスパラギン酸 | シグマ・アルドリッチ | 56勝84敗8 | 染色成分 |
| 硝酸鉛 | EMSの | 17900 | 染色成分 |
| カコジル酸ナトリウム三水和物 | シグマ・アルドリッチ | 6131-99-3 | バッファ |
| 不織布の歌 | マッケソン(株) | 94442000 | |
| マイクロアドソン鉗子 | FSTの | 11018-12 | |
| Millex-GPフィルター、0.22 um、PES 33mm、非滅菌 | EMDミリポア | SLGP033NS |
