マウスの子犬からの白と茶色の脂肪デポコレクション:マウスの子犬から白い脂肪組織と茶色の脂肪組織を収穫するための外科的処置

要約

出典: Galmozzi, A. et al. Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice. J. Vis.経験値 (2021)

このビデオでは、新生マウスから皮下白色脂肪組織と肩甲間褐色脂肪組織を分離する外科的処置を実演します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 脂肪貯蔵庫の採取と消化(1日目)

1. 子犬ごとに2本の1.5 mLチューブを準備します:1つは褐色脂肪組織(BAT)用、もう1つは白色脂肪組織(WAT)用です。250 μL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 200 μL の 2x アイソレーションバッファー (123 mM NaCl、5 mM KCl、1.3 mM CaCl₂、5 mM グルコース、100 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)、ペニシリン-ストレプトマイシン、および 4% 脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン) を各チューブに加えます。溶液を滅菌し、氷の上に保ちます。
2. 子犬を小さなチャンバー(例:6ウェルプレートの1つのウェル)に入れ、低体温になるまで氷の上に置きます。子犬と氷が直接接触しないように注意してください。意識の喪失を確実にするために先端で前足を刺し、鋭いはさみを使用して斬首して子犬を安楽死させます.
   注:異なる遺伝子型を扱う場合は、ジェノタイピングのために尾部生検(3 mmカット)を採取するための追加のチューブを準備します。ジェノタイピングがすぐに行われる場合は、安楽死させた子犬を解剖するまで氷の上に置いて脂肪貯蔵庫を収集します。
3. すべてのデポを消化するために必要なコラゲナーゼの量を計算し、計量します。2xアイソレーションバッファー中の15 mg/mLコラゲナーゼI型50 μLを各チューブに加えます。すべての組織が収集されるまで、コラゲナーゼを分離バッファーに再懸濁しないでください。
4. 皮下WATを採取するには、子犬の腹部の周りの皮膚を切開し(腹膜破裂を避け)、皮膚を脚の下にそっと引き下げます。皮膚を取らずに、大腿四頭筋の内側または上部に付着した透明(P1以下)または白(P2以上)の薄く細長い組織として現れる脂肪貯蔵庫を慎重に収集します(図1A、B)。脂肪貯蔵庫をPBSですすぎ、250 μLのPBS + 200 μLの2xアイソレーションバッファーが入ったチューブの1つに入れます。氷上を保つ.
   注:P0マウスとP1マウスは最高の収量を提供します。P0-1の子犬では、皮下WATデポはほぼ透明です。P2マウス以上では、デポはすでに白くなっており、完全に成熟した脂質を充填した白色脂肪細胞の存在を示しているため、デポの識別が容易です。
5. 肩甲骨間BATを採取するには、肩甲骨から皮膚を頭の上で引っ張ります。BATを持ち上げます(肩甲骨の間の真っ赤な組織)周囲を慎重に切開して、体から外します(図1A、B)。一貫性と色を確認してください。PBSですすいでください。250μLのPBS+200μLの2xアイソレーションバッファーを含む他のチューブに入れます。そして氷の上に保ちます.
   注:P2マウス以上からBATを採取する場合は、BATを囲む白色脂肪組織を慎重に取り除いてください。これは、皮膚と肩甲骨の間のより深いBATとの間に位置する、薄くて柔らかい白い脂肪細胞のシートで構成されています。

結果

図1:脂肪パッドの収集と処理。(A)一次白色(上)および茶色(下)の脂肪細胞単離の概略図。(B)皮下白(上)と茶色(下)の脂肪貯蔵庫。P0マウスでは、WATの皮下はほとんど見えませんが、生後~2日目には区別できるようになります。対照的に、BATはP0でもはっきりとした暗い色をしています。年長の子犬では、BATはWATの薄い表面層に囲まれており、組織を解剖するときに除去する必要があります。(C)100μmセルストレーナーによる濾過後、初期洗浄後、および単離後24時間後の初代白色および褐色前駆細胞の代表画像。スケールバー = 100 μm。略語:WAT =白色脂肪組織;BAT =褐色脂肪組織。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェルプレート	コーニング	353046
脂肪酸フリーBSA	シグマ・アルドリッチ	A8806
CaCl2	シグマ・アルドリッチ	C4901
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G7021
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J
KClの	シグマ・アルドリッチ	P9333型
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S7653
ペン/連鎖球菌	ギブコ	15140122
外科用鉗子	ROBOZ手術器具株式会社	RS-5158
手術用ハサミ	ROBOZ手術器具株式会社	RS-5880
DPBS、カルシウム、マグネシウム不使用	ギブコ	14190144

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