マウス回腸ループモデル:マウスの腸透過性を研究するための手術モデル

要約

出典:Boerner, K., et al. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、マウスモデルで腸の透過性を研究するための回腸ループモデルの生成を示しています。この方法は、上皮バリア機能とそれに伴う免疫応答を理解するためのライブモデルを提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 回腸ループの生成

1. 皮膚の準備:70%エタノールを浸したアルコール綿棒またはガーゼスポンジで腹部正中線の毛皮をこすります。低体温症を防ぐために、毛皮の広い範囲をアルコールで濡らさないでください。
2. はさみを使用して、正中線開腹術を行います。腹部の中央(長さ約2cm)に縦切開をし、腹膜を露出させます。腹腔内臓器を傷つけないように注意してください。
3. 露出した腹腔の上にプレカットされた湿った綿ガーゼを置きます。
4. 濡れた綿棒を使用して、盲腸を動員し、外部に排出します。湿った綿ガーゼに盲腸を慎重に置きます。
   手記：盲腸は、動物の性別に関係なく、ほとんどのマウスで腹腔の左尾側象限に局在しています。
5. 濡れた綿棒を使用して、末端部(遠位端)が盲腸に取り付けられている回腸を動員し、穏やかに外側にします(図1B)。
6. 腸間膜血管や血液供給を中断することなく、湿った綿ガーゼに少なくとも6cmの回腸終末を展開させます。出血がなければ血液供給は維持され、組織はピンク色を維持します(図1B).
   手記：黄色の栄養チューブにあらかじめ取り付けられた10mLの注射器を使用して、温かいHBSS(2〜3分ごと)で組織を常に湿らせておくことにより、露出した組織の乾燥を防ぎます。
7. 盲腸の近くで、腸間膜の主要な動脈を特定し、回腸に血液を供給します。次に、腸間膜に重要な血管がない2つの結紮部位を見つけます。
8. 鈍い組織鉗子を使用して、回腸末端(盲腸に最も近い)をしっかりとつかみ、細い先端の鉗子を使用して、血管を避けて腸間膜を開窓にします。穿孔全体に絹の縫合糸を配置し、外科的結び目を結んで最初の結紮(ループの遠位端)を作成します。
9. 定規を使用して、最初の結紮糸から4 cm離れて測定し、手順2.8で説明したように2番目の結紮糸(ループの近位端)を作成します(図1C)。
10. 細いハサミで各結紮の隣を慎重にカットして4cmの回腸ループを分離し、血液供給と腸間膜を無傷に保ちます><。 手記：iLoopの外部セグメントの両端を切り取り、管管内容物(糞便)との干渉を防ぐために必要なステップとして穏やかに洗い流すことで、単離されたセグメントの全長にわたってFITC-デキストランまたは走化性刺激の均一な分散を促進し、フローサイトメトリーによる白血球のより正確な定量を可能にします。この手順により、指定された量の試薬を注入した後の粘膜の均一な膨張が可能になり、動物間の再現性が向上します。
11. 10 mLシリンジに取り付けられた柔軟な黄色の栄養チューブを使用して、回腸ループセグメントの内容物を温かいHBSSで静かに洗い流します。.
12. 洗い流された回腸ループの2つの切断端を絹糸糸を使用して結紮します。
13. 30 G針付きの1 mLシリンジを使用して、FITC-デキストランやケモカインなどの試薬250 μLを腸管腔にゆっくりと注入します。回腸ループが膨らみ、粘膜が中等度に膨張します(図1D)。
    手記：腸間膜動脈の反対側にあるループ内腔に試薬を注入します。注入中は、血管が裂けて出血を誘発しないように、回腸ループを動物から引き抜かないように注意してください。
14. 濡れた綿棒を使用して、回腸ループ、近位回腸、および盲腸をそっと元に戻します。
15. ニードルホルダー、解剖学的鉗子、逆切断針付きの3.0非吸収性シルク縫合糸を使用して、腹壁を閉じます。
16. 潜伏期間中、動物を温度調節された麻酔チャンバーに入れます。

結果

図 1:回腸ループモデル。(A)回腸ループモデルの概略図。開腹術の中央値は、麻酔下でマウスに行われ、温度制御された手術ボードの上に置かれます。(B)盲腸(*)、回腸および腸間膜の外部化。結紮に適した2つの部位が特定されます(1,2)。(C)長さ4cmのセグメントを分離します:最初の結紮糸(1)は回腸-盲腸接合部の近くに配置され、2番目の結紮糸(2)は最初の結紮糸から4cm離れて配置されます。(D)腸間膜(1、2)に2つの小さな切開を行い、長さ4cmの回腸ループを作成します。管腔内容物の除去とカットエンドのライゲーション後、蛍光マーカーや化学誘引剤などの試薬を内腔に注入できます。回腸ループは血管新生が良好です(黒い矢印)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
設備・資材
BDアルコールスワブ	BDの	326895
BD PrecisionGlide ニードル、25G X 5/8インチ	BDの	305122
BDプレシジョングライドニードル、30G X 1/2インチ	BDの	305106
BD 1mL ツベルクリンシリンジ(針なし)	BDの	309659
15ml遠心分離管	コーニング	14-959-53A
Corning 96ウェルソリッドブラックポリスチレンマイクロプレート	フィッシャーサイエンティフィック	07-200-592
Corning 未処理培養皿 10cm	ミリポアシグマ	CLS430588
コットンチップアプリケーター(綿棒)、6インチ、滅菌済み	フィッシャーサイエンティフィック	25806 2WC
Dynarex コットン充填ガーゼスポンジ、非滅菌、2インチ x 2インチ	メデックス	3249-1
EZ-7000 麻酔気化器(クラシックシステム、暖房ユニットを含む)	E-Zシステム	EZ-7000
モリアファインハサミ	FSTの	14370から22
Puralube Vet 軟膏、滅菌眼用潤滑剤	デクラ	12920060
リング鉗子(鈍的組織鉗子)	FSTの	11103-09
ロボズサージカル4-0シルクブラックブレイド、100ヤード	フィッシャーサイエンティフィック	NC9452680
Semken鉗子(解剖学的鉗子)	FSTの	1108-13
Sofsilk非吸収性コーティングブラック縫合糸編組シルクサイズ3-0、18インチ、針19mm長さ3/8円リバースカット	ヘンリー・シャイン	SS694
学生用細い鉗子、角度付き	FSTの	91110から10
針なしの10mlシリンジPP / PE	ミリポアシグマ	Z248029
げっ歯類用黄色の栄養チューブ20G x 30 mm	インステック	FTP-20-30
ソリューションとバッファー
ハンクスのバランスの取れた塩溶液	コーニング	21-023-CV
カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水	コーニング	21-040-履歴書
イソフルラン	ハロカーボン	12164-002-25