マウス近位結腸ループモデルの生成:管腔内注射後の血清中の蛍光マーカーの検出により、近位結腸ループを生成し、腸の透過性を測定する外科的処置

要約

出典:Boerner, K. et al. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、マウス近位結腸ループまたはpcLoopセグメントを生成する外科的処置と、その後に蛍光マーカーをセグメントに注入して腸上皮透過性を研究する手順について説明します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 近位結腸ループの生成 (pcLoop)

1. 皮膚の準備:70%エタノールを浸したアルコール綿棒またはガーゼスポンジで腹部正中線の毛皮をこすります。低体温症を防ぐために、毛皮の広い範囲をアルコールで濡らさないでください。
2. はさみを使用して、正中線開腹術を行います。腹部の中央(長さ約2cm)に縦切開をし、腹膜を露出させます。腹腔内臓器を傷つけないように注意してください。
3. 露出した腹腔の上にプレカットされた湿った綿ガーゼを置きます。
4. 濡れた綿棒を使用して、盲腸を動員し、外部に排出します。濡れた綿ガーゼに盲腸を慎重に置きます.
   手記： 盲腸は、動物の性別に関係なく、大多数のマウスの腹腔の左尾側象限に局在しています。
5. 濡れた綿棒を使用して、回腸全体を外側に出し、濡れた綿ガーゼの上に置きます。近位結腸と中結腸にある血液供給を特定します。近位結腸を動員し、細い先端鉗子を使用して、盲腸から約0.5cm遠位にある中結腸の血管のない領域に最初の結紮糸を作成します(図1B)。
6. 最初の結紮糸から2cmを測定し、中結腸の血液供給のない領域に2番目の結紮糸を作成します(図1C)。
7. 細いハサミを使用して、各ライゲーションの隣で慎重にカットし、長さ2 cmのpcLoopを分離します。
   手記：細いハサミで各結紮の隣を慎重に切って4cm回腸ループを分離し、血液供給と腸間膜を無傷に保ちます。両端を切り取って、管腔内容物が優しく洗浄されたpcLoopを分離することが重要です。結腸組織と中結腸を慎重に切断して、小さな血管が腸管腔に出血するのを防ぎます。必要に応じて、切開部位での出血を制限するために温熱焼灼を使用します。
8. 10 mLシリンジに取り付けられた柔軟な黄色の栄養チューブを使用して糞便を取り除くために、温かいHBSSでpcLoopを静かに洗い流します(温かいHBSSで満たされた10 mLの注射器を準備し、黄色の栄養チューブに取り付けます。この注射器は、手術中に露出した組織の保湿に使用されます)。
9. フラッシュされたpcLoopの2つの切断端をシルク縫合糸を使用して結紮します。
10. 30G針付きの1mLシリンジを使用して、FITC-dextrans(HBSSで1mg / mL)などの試薬200μLをゆっくりと注入します。未使用のFITC-デキストラン溶液を光から保護して、血清採取後の標準曲線を準備してください。pcLoopは膨らみ、粘膜の中程度の膨張を引き起こします(図1D).
    手記：腸間膜動脈の反対側にあるpcLoop内腔に試薬を注入します。動物間の一貫性を確保し、粘膜の均等な膨張を確保するために長さ2cmのpcLoopを作成します。
11. 濡れた綿棒を使用して、結紮されたpcLoop、回腸、盲腸を腹腔内に静かに戻します。
12. ニードルホルダー、解剖学的鉗子、逆切断針付きの3.0非吸収性シルク縫合糸を使用して、腹壁を閉じます。
13. 潜伏期間中、動物を温度調節された麻酔チャンバーに入れます。

結果

図1:近位結腸ループモデル。(A) pcLoopモデルの概略図概要。開腹術の中央値は、温度制御された手術ボードに置かれた麻酔下でマウスに行われます。(B)盲腸(*)、近位結腸、中結腸、回腸の外部化。結紮に適した2つの部位が特定されます(1,2)。(C)最初の結紮糸(1)は盲腸の近くに配置され、2番目の結紮糸(2)は最初の結紮糸からさらに2cm遠位に配置されます。(D)pcLoopを外部に出し、管腔内容物を洗浄し、蛍光マーカーや化学誘引剤などの試薬で膨らませます。pcLoopは、近位結腸の血管新生された2cmのセグメントです(黒い矢印は血液供給を示します)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
設備・資材
BDアルコールスワブ	BDの	326895
BD 1mL ツベルクリンシリンジ(針なし)	BDの	309659
BD PrecisionGlide ニードル、25G X 5/8インチ	BDの	305122
BDプレシジョングライドニードル、30G X 1/2インチ	BDの	305106
コットンチップアプリケーター(綿棒)、6インチ、滅菌済み	フィッシャーサイエンティフィック	25806 2WC
Dynarex コットン充填ガーゼスポンジ、非滅菌、2インチ x 2インチ	メデックス	3249-1
EZ-7000 麻酔気化器(クラシックシステム、暖房ユニットを含む)	E-Zシステム	EZ-7000
キムワイプ(小)(ティッシュワイプ)	フィッシャーサイエンティフィック	06-666
モリアファインハサミ	FSTの	14370から22
Puralube Vet 軟膏、滅菌眼用潤滑剤	デクラ	12920060
リング鉗子(鈍的組織鉗子)	FSTの	11103-09
ロボズサージカル4-0シルクブラックブレイド、100ヤード	フィッシャーサイエンティフィック	NC9452680
セムケン鉗子(解剖学的 鉗子)	FSTの	1108-13
Sofsilk非吸収性コーティングブラック縫合糸編組シルクサイズ3-0、18インチ、針19mm長さ3/8円リバースカット	ヘンリー・シャイン	SS694
学生用細い鉗子、角度付き	FSTの	91110から10
針なしの10mlシリンジPP / PE	ミリポアシグマ	Z248029
試薬
イソフルラン	ハロカーボン	12164-002-25
フルオレセインイソチオシアネート-デキストラン、平均分子量4.000	シグマ	60842-46-8