筋線維の単離:採取したマウス伸筋長指筋(EDL)から単一の筋線維を取得する技術

要約

出典: Hüettner, S.S. et al. Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオは、採取したマウス伸筋長伸筋(EDL)からの単一筋繊維の分離を示しています。単離された筋線維は、筋線維関連筋幹細胞の活動を研究するために培養することができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. EDLの筋肉の分離とコラゲナーゼ消化

1. 汚染を避けるために、すべての機器に70%エタノールをスプレーします。
2. 動物実験に関する国内規則に従ってマウスを犠牲にしてください。
3. マウスの後肢に70%エタノールをスプレーします。硬化した細かい湾曲したハサミ(24mmの刃先)と細い鉗子(デュモン7、湾曲またはストレート)を使用して皮膚を取り除き、下にある筋肉を露出させます。下にある筋肉が毛皮に接触しないようにしてください(汚染のリスクを高めます)。
4. 下にある筋肉に損傷を与えることなく、細かく湾曲した鉗子で周囲の筋膜を取り除きます(図1A)。曲がらないように鉗子を閉じてください。
5. 湾曲した鉗子を使用して、TA(前脛骨筋)とEDL筋の遠位腱を露出させます。TAを取り外すには、遠位TA腱を鉗子でつかみ、細いバンナススプリングハサミ(刃先5mm、先端径0.35mm)で切ります。TAを腱で保持しながら、膝に向かって引っ張り、膝の近くで筋肉を切断すると(図1B)、EDL筋が露出します
   手記：このステップでは、TA腱のみをつかむようにしてください、そうしないと、下にあるEDLが損傷する可能性があります。TA筋を切断するときは、膝の腱が後で簡単に見えることを確認してください。
6. 細かい湾曲した鉗子で遠位EDL腱を持ち上げ、細いバンナススプリングハサミで切断します(図1C)。EDLを慎重に膝に向かって引っ張って、近位EDL腱を露出させます。近位腱を細いバンナスのスプリングハサミで切ります。EDL筋を37°Cに予熱した2.5mLのコラゲナーゼ消化液に15mLの反応チューブに移します。コラゲナーゼ溶液は、以下の手順に従って調製されます。
   1. コラゲナーゼ消化溶液を調製するには、0.2%(w/v)コラゲナーゼ1型(Clostridium histolyticum由来)をDMEM(4.5 g/Lグルコースとピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコの改変イーグル培地)に溶解し、0.22 μmフィルターでろ過します。(図1D).
      手記：膝の外側の結合組織を小さく切開して、近位のEDL腱を完全に露出させます。腱だけをつかむようにし、EDLを伸ばしすぎないようにしてください。
7. 手順 1.3. から 1.6 を 2 番目の EDL で繰り返します。2.5 mLコラゲナーゼ消化溶液を充填した同じ15 mL反応チューブに、両方のEDL筋を加えます。
8. 反応チューブ内のEDL筋を37°Cの循環水浴でインキュベートします
   手記：インキュベーション時間は、コラゲナーゼ活性、マウスの年齢、線維性組織の量など、いくつかの要因によって異なります。成体マウス(生後2〜6ヶ月)のEDL筋の典型的な潜伏時間は1〜1.5時間、老齢マウス(生後18ヶ月)の典型的な潜伏時間は1.5〜2時間です。
9. 筋肉の過度の消化を避けるために、消化時間中に筋肉をチェックしてください。筋肉が緩み、単一の筋繊維が見えたら、消化を停止します(図1E)。大口径ピペットを使用して、次のように調製した筋繊維分離培地を含む予熱した12ウェルプレート(図1G)の最初のウェルに筋肉を慎重に移します。
   1. DMEM(4.5 g / Lグルコースとピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコの改変イーグル培地)に20%FBS(ウシ胎児血清)を補充し、0.22μmフィルターでろ過します。アイソレーションの約30分前に、プレコートされたアイソレーションプレート(12ウェルプレート、ウェルあたり2〜4 mLのアイソレーション培地)に培地を加え、加湿した37°Cインキュベーターで5% CO₂で平衡化します。

>2. 筋線維の解離

1. 次の手順では、加熱プレート(37°C)を優先的に装備した実体双眼顕微鏡を使用します。大口径ピペットを使用して、単一の筋繊維が放出されるまで、温かいアイソレーションメディウムで筋肉を洗い流します。必要な数の筋繊維が溶液中に自由に浮かぶまで、筋肉を大口径ピペットで解離します。
   手記：筋繊維が損傷するリスクを減らすために、過度のトリチュレーションは避けてください。筋線維の解離には加熱プレートを使用することを強くお勧めします。これは、分離プロセス中に温度が下がり、筋線維が死滅するためです。

結果

図 1.マウスEDL解剖と単一筋線維分離。(A)マウス後肢の皮膚を切除し、筋膜を囲む筋肉を引き離してTA(前脛骨筋)を露出させます。(B)TA筋を取り外して、白い矢印でマークされたEDL(extentorum longus)筋肉を露出させます。(C)EDL筋は、その腱を切断することによって解剖されます。(D)2つのEDL筋がコラゲナーゼ消化されます。(E)コラゲナーゼ消化された筋肉の外観で、組織コアから見える単一の筋繊維が緩んでいます。(F)スケール付き大口径および小口径パスツールピペット。(G

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラゲナーゼ1型	シグマ	C0130
DMEM(4.5 g / lグルコースとピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコの改変イーグルの培地)	ギブコ	41966029	細胞培養培地
ウシ胎児血清	ギブコ	10270-106	ウシ胎児血清