細菌性眼内膜炎マウスモデル:マウスの眼への細菌懸濁液の硝子体内注入による細菌性眼内炎の作製法

要約

出典: Mursalin, M. H. et al., Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオでは、細菌性眼内炎(眼の硝子体腔への細菌の侵入に起因する眼内感染)を模倣するマウスモデルを、細菌懸濁液を眼に注入することで生成する方法を説明しています。このマウスモデルは、疾患のメカニズムを研究し、その治療法を評価するのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 滅菌ガラス針

1. ニードルピペットプーラーの電源を入れます。
2. ディスプレイに12.6が表示されるまでヒーターノブを調整します。
3. ドアを開け、チューブの半分がフィラメントの下に伸びるまで、5μLのキャピラリーチューブを上部クランプとヒーターフィラメントに手動で送ります(図1A)。
4. キャピラリーチューブが上部クランプの「V」溝にあることを確認します。上部clを締めますamp。
5. 下部clでamp 開いた状態で、下部clが上限に達するまで垂直スライドを手動で上に調整します。チューブが下部クランプの「V」溝にあることを確認します。下部クランプを締めます。
6. ドアを閉め、「準備完了」ライトが点灯していることを確認します。スタートボタンを押して、ヒーターと引っ張りのシーケンスを開始します(図1B)。
7. 熱と重力によってキャピラリーチューブが引き離され(図1C)、スライドが下に移動した後、ヒーターが自動的にオフになることを確認します。
8. 戸を開けて下さい。キャピラリーチューブの上部を保持したまま、上部クランプを緩めます。上部キャピラリーチューブを取り外し、脇に置きます。
9. キャピラリーチューブを下部スライドに保持し、下部クランプを緩めます。下部キャピラリーチューブを取り外し、脇に置きます。
10. 0.05 μmのアルミナ研磨研削プレートを備えた微小電極ベベラーを使用して、引っ張られたキャピラリーチューブをベベルし、注入針を作成します。
11. 表面を覆うのに十分な水を粉砕プレートにピペットで移します(図1D)。
12. ベベラーをオンにして、60rpmで回転し始めます。引っ張ったキャピラリーチューブをピペットclに入れますclamp 「V」字溝。clを締めますamp ピペットclの角度を調整しますamp 30°に。
13. キャピラリーチューブの尖ったエッジの先端を、研削プレートの回転中心から約3分の2の距離で調整します。
14. マニピュレーターの上部にある粗いコントロールノブを調整して、クランプされたキャピラリーチューブを下げます。キャピラリーチューブの先端が水面下に伸び、研削プレートの研磨面に接触するまで、キャピラリーチューブを下げ続けます。
15. ベベラーに取り付けられた顕微鏡を使用して、ベベルの進行状況を監視します。5分後、ファインコントロールを調整して、ガラス針を粉砕プレートから持ち上げます。
16. ガラス針を取り外し、10倍の倍率で置き、キャピラリーチューブの先端を確認します(図1E、F)。
17. 詰まりがないように、ガラス針をシリンジのピペットホルダーに挿入し、99%エタノールの1mLチューブに空気を押し込みます。.針の先端に気泡ができても、針に詰まりはなく、マイクロインジェクションに使用することができます。このプロセスにより、ガラス針の無菌性も保証されます。
18. 1本のキャピラリーチューブに最大5μLの液体を保持できます。キャピラリーチューブを10のセクションにマーキングして、0.5μLの容量でマーキングする針上の距離を計算します。将来の準備のために、0.5μLを保持するその距離でスケールをマークします。5 μLの針の場合、0.7 mmの距離は0.5 μLに相当します(図1G)。

>2. マウス硝子体内注射

1. このセクションのすべての手順をバイオセーフティレベル2の条件下で実行します。
2. 手術台に医療用アンダーパッドを置いて、手術部位を準備します。
3. マイクロインジェクターの電源を入れ、マイクロインジェクターに取り付けられた圧縮空気タンクのガスバルブを開きます。ガス供給量が約60psiになるまで、タンクレギュレーターを調整します。
4. マイクロインジェクターで、画面にバランスが表示されるまでモードを押します。天びんを押して、コンピューターのマウスを手術台に置きます。ステンレス製ピペットホルダーをインジェクターの「Fill / Output」に取り付けられたチューブに接続します。このチューブは常にインジェクターに接続されています。
5. ピペットホルダーコネクタを針の周りにしっかりとねじ込んで、キャピラリーニードルをピペットホルダーのもう一方の端に挿入します。
6. 眼科用顕微鏡の電源を入れ、50%の強度でライトをオンにします。手術台の手術部位に顕微鏡を合わせ、顕微鏡を希望の焦点に調整します。
7. 手順を開始する前に、ペダル離脱反射をテストして、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。麻酔については、IACUCが承認したプロトコルに必ず従ってください。
8. 麻酔をかけたマウスを、鼻を右に向け、左側に傾けて、医療用アンダーパッドに置きます。
9. 眼科顕微鏡でマウスの右目を観察し、眼の両側にある逆作用鉗子のトングを開いてまぶたを開き、注射部位を露出させます(図2C)。
10. マイクロインジェクターに接続されたマウスパッドを左クリックして、毛細血管針にセレウス菌(ATCC 14579)細菌溶液(200 CFU/μL希釈)を充填します(図2D)。
11. 動物の頭を左手で固定し、針の先端を目の辺縁に置きます。針を斜角にして45°の角度でマウスの眼に穴を開けますが、注射時には針の鋭い先端(~0.5mm)のみが挿入されるようにしてください。
12. 針先を挿入したら、左手をマウスヘッドからマウスパッドに移動し、マウスパッドを右クリックして、Brain Heart Infusion(BHI)ブロスで調製した0.5μLのセレウス菌希釈液を注入します。漏れを防ぐため、針先をマウスの目の中に2〜3秒間置いてから取り外してください(図2E)。
13. 鉗子を放し、マウスをウォーミングパッドの上に置かれているケージに入れます。これらのマウスが麻酔から回復するまで監視します(図2F)。
14. マウスが麻酔から回復したら、ケージを適切なラックに戻します。マウスを網膜電図法による網膜機能解析にかける場合は、適切な暗順応のためにケージを暗室に戻す必要があります。

結果

図1:面取りガラス針の製作。 ガラス針は、使い捨てのマイクロキャピラリーピペットから、ニードル/ピペットプラーとマイクロピペットベベラーを使用して作られました。(A)ニードル/ピペットプーラーにクランプされたガラスキャピラリーチューブ。(B,C)所望の電圧を使用してガラス針を作成します。(D)ガラスマイクロピペットの面取り。(E,F)面取り前と面取り後のガラス製マイクロピペット。(E)ガラス針をスケーリングします。2つの黒い点の間のスペースは0.5μLを保持します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞マイクロインジェクター	MicroData Instrument, Inc. (マイクロデータインストゥルメント)	PM2000	NAの
マイクロキャピラリーピペット5マイクロリットル	キンブル	71900-5	NAの
マイクロピペットベベラー	サッターインストゥルメント株式会社	BV-10	NAの
顕微鏡 OPMI Lumera	ツァイス		NAの
逆作用鉗子	カテナ	品番5-8228	NAの