細菌感染定量アッセイ:細菌性眼内炎のマウスモデルにおける眼内細菌負荷を定量化する方法

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 採取チューブの準備

1. 1 mmの滅菌ガラスビーズを1.5 mLのスクリューキャップチューブに入れます。
2. これらのチューブは、乾燥した環境のオートクレーブで滅菌します。チューブを室温まで冷ましてから使用してください。
3. 10 mLの1x滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を滅菌15 mL遠心チューブに加えます。
4. プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤1錠をチューブに加えます。ボルテックスで混ぜます。
5. プロテアーゼ阻害剤を含む1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を400 μLをオートクレーブ処理した各収穫チューブにピペットで移します。チューブにラベルを付け、氷の上に置きます。(図1A)。

2. 目の収穫

1. このセクションのすべての手順をバイオセーフティレベル2の条件下で実行します。
2. CO₂吸入によりマウスを安楽死させます。安楽死を確認するために二次的な方法を使用してください。
3. 安楽死させたマウスの頭部をしっかりと保持し、感染した目の両側にある細い先端鉗子を開きます。頭に向かって押し下げて、目を支えます。トングが目の球の後ろに来たら、トングを一緒に押し込みます。鉗子を頭から引き離して、眼球を取り外します(図1B)。
4. すぐに眼球をラベル付きの採取チューブに入れます。チューブを氷の上に60分以内に置きます(図1C)。

3. 眼内細菌数

1. このセクションのすべての手順をバイオセーフティレベル2の条件下で実行します。
2. 組織ホモジナイザー内で、すべてのハーベストチューブがしっかりと閉じられ、バランスが取れていることを確認します(図2A)。ティッシュホモジナイザーを1分間オンにして、サンプルを均質化します。30 秒待ってから、さらに 1 分間電源を入れます。チューブを氷の上に置きます(図2B、C)。
3. 20 μL のホモジネートを 180 μL の滅菌 1x PBS に順次移し、各サンプルを 10 倍に連続希釈します。係数が^10-7に達するまで希釈します(図2D)。
4. 温かみのある正方形のBHIプレートの各列に、適切な希釈係数をラベル付けします。各希釈液の10 μLを、約45°傾けた上部BHIプレートに一列に並べて移します。サンプルがプレートの底にほぼ到達するまでサンプルを流してから、プレートを平らに置きます(図2E)。
5. サンプルがBHI寒天に吸収されたら、プレートを37°Cのインキュベーターに移します。コロニーは、インキュベーターに入れられてから8時間後に見え始めるはずです。
6. B. cereusのコロニーの成長が個々のコロニーの同定を妨げる前に、インキュベーターからプレートを取り外してください(図2F)。
7. サンプル中の濃度を正確に表すには、10〜100のコロニーを持つ行をカウントします。例えば、希釈画分が ^10-4 の行で、コロニーが 45 の場合、濃度は 4.5 x 10⁵ CFU/mL になります。
8. 眼当たりの細菌の総数を計算するには、濃度に0.4を掛けます。これは、眼の均質化に使用される1x PBSのミリリットル体積を表します。例えば、4.5 x 10⁵ CFU/mL の濃度は、1 眼あたり 1.8 x 10⁵ CFU セレウス
菌に相当します。

図1:マウスに感染した眼の採取 感染後、所望の時点以降、滅菌ピンセットを使用して感染したマウスの眼を採取する。(A)滅菌ガラスビーズを含むPBS。(B)感染した眼の採取。(C)マウスの目が入った採取チューブ。

図2:眼内細菌数のための採取した眼の処理 (A)感染した眼を組織ホモジナイザーにしっかりと固定した採取チューブ。(B)感染した眼を1分間ずつ2回均質化した。眼球ホモジネート(C)の希釈(D)とその後のプレーティング(E)を追跡し、細菌定量を行います。(E)トラック希釈後の代表的な個々のセレウス菌コロニー。