出典:Pacheco-Baltazar, A., et al., Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model. J. Vis. Exp. (2021).
このビデオは、孤立した肺灌流のためのex vivo技術を示しています。これは、肺移植手順に関与するさまざまな生理学的および病理学的メカニズムの研究を支援する肺研究用のツールです。
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方法論記事
ex vivo肺灌流:ウサギモデルにおける肺研究の手法
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. カニューレ挿入:
- 分離したばかりのウサギの肺を心臓と一緒にペトリ皿の滅菌ガーゼの上に置きます。
- 無気肺を防ぐために、呼気終末陽圧 (PEEP) を 2 cmH2O に設定した陽圧換気を使用して肺を換気します。
- 心室を房室溝のレベルで心臓から切り取ることにより、心室を切除します。
- 2つの心室を開いた後、ウサギ用のOD 4.6 mm肺動脈カニューレをバスケットで肺動脈に導入し、ウサギ用のOD 5.9 mm左心房カニューレをバスケットで僧帽弁を通って左心房に導入します。
- 肺動脈と左心房に4-0シルク縫合糸を使用して、カニューレを固定します。肺動脈と左心房の結紮糸に周囲の組織を含めて、これらの構造の膨張を防ぎます。
- 動脈カニューレから250mLの生理食塩水等張液を注入して、血管床から残りの血液を洗い流します。.
2. 灌流技術:
- セットアップ：
- 孤立した肺を慎重に肺室に入れます。.
- 気管をチャンバーのカバーにあるトランスダクターに取り付けます。
- カニューレを装着した血管を灌流システムに接続します。
- チャンバーを閉じ、ロータリーロックで固定します.
手記：再循環灌流回路は、開放静脈リザーバー、蠕動ポンプ、熱交換器、およびバブルトラップで構成されています。 - この時点で、チャンバーの蓋を取り付け、ストップコックを切り替えて、正圧換気から負圧換気に切り替えます。肺の陰圧換気とチャンバーの気密閉鎖を確認するには、圧力計で肺とチャンバーの圧力の呼吸エクスカーションを検査します。
- 200 mLの人工無血灌流液(ウシアルブミンを2.5%含むクレブスリンガー重炭酸緩衝液)で肺を灌流します。.
- 灌流液の流れを3 mL/min/kgで開始し、5分間かけてゆっくりと5 mL/min/kgまで段階的に増やします。次の 5 分間で 8 mL/min/kg の流量に達し、さらに 5 分後に最大フラックスが 10 mL/min/kg に達します。回路に空気が入らないように注意してください.
手記：灌流液のpHと温度を生理学的範囲(pH 7.4-7.5;温度、37°C-38°C)内に維持します。.pHを調整するには、NaHCO3(1N)を添加するか、二酸化炭素の流量を増やします。あるいは、HCl(0.1N)を使用して酸性化します。
- パラメーター：
- 所定の灌流および換気パラメータが必要に応じて設定されているかどうかを確認します。
- 30 bpmの頻度、10 mL / kgの一回換気量、および2 cmHの呼気終末圧(Pe)で加湿された空気で肺を換気します2 cmH2O.
手記：肺動脈圧(0-20 mmHg)は、酸素供給器またはリザーバーの液面の高さ(肺幹からセンチメートル)に対応し、肺静脈圧は左心房の上の圧力平衡チャンバーの高さに対応します。どちらの値も変更できます。左心房圧力も0〜20mmHgであることに注意してください。
- ゾーン3の条件の達成:
- 肺動脈、左心房、圧力トランスデューサに固定されたカニューレのサイドポートに接続された2本のカテーテルを使用して、動脈(Pa)と静脈(Pv)の圧力を測定します。
- ベースライン圧力を肺門のレベルに設定します(ゼロ基準)。
- ゾーン3の換気条件下で実験を行います。これを達成するには、10〜15分待って、等重量分析状態を特徴とする平衡を取得します。
- ゾーン3の状態が発生するには、静脈圧が肺胞圧(Palv)よりも高く、動脈圧が両方(Pa > Pv > Palv)よりも高いままであることを確認してください。
- 肺の重量が一定に保たれ、動脈圧と左心房圧が安定し、実験中に最大数の肺血管を開き、微小血管床の内容を維持するためのゾーン3条件を達成していることを確認します><。 手記：肺水腫の指標としてのKfcの測定は、手動灌流システムと自動灌流システムの間で変動はありません。
- 電子制御と信号処理:呼吸流量、体重変化、微小血管圧、潮汐量、血管抵抗などが、トランスデューサーからの信号を統合して評価システムに表示する複数の中央電子ユニットに登録されていることを確認します。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2 ストップ Tygon E-Lab チューブ、内径 3.17 mm 、12/パック、ブラック/ホワイト | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 73-1864 | |
| IPL-4の陽圧換気用アダプター | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-4312 | |
| IPL-4の陽圧換気用アダプター | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-4312 | |
| IPL-4の代替無圧ガス供給:負の換気中に室内空気とは異なる混合ガスを気管に供給する | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-4309 | |
| ウサギから胎児へのブタ分離灌流肺のベースユニット | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-4138 | |
| ウシ血清A2:D41アルブミン凍結乾燥粉末 | シグマ | 3912 | 500グラム |
| 塩化カルシウム、CaCl2・2H2O。 | JTベイカー | 10035 04 8 | |
| 極低温バイアル | コーニング | 430659 | 2ミリリットル |
| D-グルコース、C6H12O6。 | シグマ | G5767 | |
| 差圧式低圧トランスデューサ DLP2.5、レンジ +- 2.5 cmH2O、HSE コネクタ | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-3882 | |
| 差圧トランスデューサMPX、範囲+-100 cmH2O、HSEコネクタ | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-0064 | |
| エッペンドルフチューブ | |||
| エタノール絶対HPLCグレード | カレドン | ||
| ファルコンチューブ | 14ミリリットル | ||
| ハーバード蠕動ポンプP-230(コントロールボックスとP-230モータードライブ付き) | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒70-7001 | |
| 加熱式リニアニューモタコメーター 0 〜 10 L/min の流量範囲 | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒59-9349 | |
| シングルニューモタコメーター用ヒーターコントローラー 230 VAC、50 Hz | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒59-9703 | |
| ヘパリン | ピサ | 5000 UI | |
| HPLCカラム(C18 100A 5U) | オールテック | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| 親水性シリンジフィルター | ミッレクス | SLLGR04NL | 4ミリメートル |
| IPL-4 単離ウサギからブタ胎児への肺コアシステム, 230 | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-4296 | |
| 緩衝液用ジャケット付きガラスリザーバー、フリットとチューブ付き、6.0 L | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-0322 | |
| ラウダサーモスタットサーキュレーター、タイプE-103、230 V / 50 Hz、バス容量3 L、温度範囲20〜150°C | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-0125 | |
| 左 アトリウム カニューレ ウサギ用 バスケット付き, OD 5.9 mm | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-4162 | |
| 低範囲血圧トランスデューサ P75 ( PLUGSYS モジュール用 | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-0020 | |
| 硫酸マグネシウム七水和物、MgSO4・7H2O | JTベイカー | 10034-99-8 | |
| マイクロ遠心チューブ | コーニング | 430909 | |
| IPL-4用圧力調整器付き負圧換気制御オプション | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-4298 | |
| ニュージーランドのウサギ | |||
| PISABENTAL(ペントバルビタールナトリウム) | ピサ | 質問番号 7833-215 | |
| PLUGSYSケース、タイプ603* 7 | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-0045 | |
| PLUGSYS TCMタイムカウンターモジュール | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYSトランスデューサアンプモジュール(TAM-A) | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-0065 | |
| PLUGSYSトランスデューサアンプモジュール(TAM-D) | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R 圧力調整器付き換気制御モジュール | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 73-1755 | |
| 塩化カリウム、KCl。 | JTベイカー | 3040-01 | |
| リン酸二水素カリウム、KH2PO4 | JTベイカー | 7778-77-0 | |
| バスケット付きウサギ用肺動脈カニューレ、外径4.6 mm | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-4161 | |
| 灌流用サーボコントローラ(SCP | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-2806 | |
| スナップキャップマイクロ遠心チューブ | 共演者 | 3620 | 1.7ミリリットル |
| 重炭酸ナトリウム、NaHCO3 | シグマ | S6014 | |
| 塩化ナトリウム、NaCl。 | シグマ | S9888 | |
| 手術用手袋 No. 7 1/2 | |||
| 手術用手袋 No.8 | |||
| タイゴンチューブ | マスターフレックス | ||
| ウサギ用気管カニューレ、外径5.0 mm | ヒューゴ・ザックス・エレクトロニック (HSE) | 〒73-4163 |
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