実験的介入のための同時ビデオ-EEG-ECG-酸素濃度計-カプノグラフィーのための意識のあるウサギモデルの準備:ウサギモデルにEEE-ECG電極を埋め込み、呼吸プローブを取り付ける手順

要約

出典:Bosinski, C. et al., 意識のある拘束ウサギの発作、不整脈、無呼吸の同定のためのマルチシステムモニタリング。

このビデオでは、ウサギモデルにEEG-ECG電極を埋め込み、呼吸プローブを取り付けて、その生体信号の記録を取得および分析する手順を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 脳波-心電図電極の埋め込みと呼吸モニターの取り付け

1. 輸送キャリアからウサギを1匹取り出し、座っている調査員の膝に置きます。
2. ウサギを垂直に持ち、研究者の体に近づけます。
3. ウサギの頭を研究者の膝に置き、ウサギの頭を体の他の部分よりも低くして、ウサギを仰向けの位置に下げます。
   手記：この操作により、動物はリラックスし、電極を配置しながら移動したり逃げたりする可能性を最小限に抑えます。
4. ウサギが仰臥位に固定されたので、皮膚が識別され、下にある組織から分離されるまで、2番目の研究者に毛皮を広げるように依頼します。
5. 35°曲げた電極を各腋窩に皮下に挿入します(図1A).
   手記：電極は、皮膚にしっかりと引っ掛けられるように押し込む必要がありますが、より深い構造には浸透しません。電極を皮膚から出入りさせる(スルーアンドスルー)と、ウサギを拘束具に置いたとき、または実験中にウサギが移動したときにリード線が外れる可能性が低くなります(図1B)。すべての電極は、配置前に70%エタノールで滅菌されます。
6. リード線を胸部の右前肢と左前肢の後部、および左後肢の前方の腹部に配置します。腹部の右後肢の前方にアースピン電極を置きます(図2A)。
7. すべてのECGリードが適切に配置されたら、ウサギを腹臥位に戻し、リード線がウサギの腹部の片側を駆け上がるようにし、ウサギを適切なサイズの拘束具(例:6 "x 18" x 6")に移します。実験中にワイヤーがウサギの下に引っかからないように、ワイヤーを拘束具の側面にテープで留めます(図2B)。
8. 首の周りの拘束具を下げて所定の位置に固定することにより、ウサギを拘束具に固定します。さらに、後肢を動物の下に移動させ、後肢を固定します。
   手記：首の下のスペースに1〜2本の指を収めて、きつすぎないようにする必要があります。特に運動運動がある可能性のある実験では、動き、潜在的な脊椎損傷、四肢の脱臼、および後部拘束を蹴り出す能力を最小限に抑えるために、拘束具を締めることが重要です(図2B)。ウサギは、運動の増加や脱水症状に関連する問題なしに、~5時間拘束装置に維持されています。
   1. 小さなウサギ(例:2か月未満)の場合、ウサギを持ち上げるために動物の下にゴム製のブースターパッドを置き、ウサギが首をヘッドレストの底に載せるのを防ぎます(図2C).
      手記：呼吸数と心拍数の急激な低下は、首のインピンジメントに続発する可能性があります。これが発生した場合は、首の拘束具を緩め、ウサギの頭を持ち上げて首の圧迫を和らげます。.
   2. リアレストがウサギの背中/背骨を密接にトレースしない場合は、PVCスペーサーを配置して、脊椎の損傷を引き起こす可能性のある動きを防ぎます。
      手記：たとえば、長さ~14 cm x 内径4インチのPVCパイプは、下部の25〜33%を取り除いた状態で、適切な拘束を提供するために発泡スチロールでウサギの上に置くことができます(図2C)。
9. ウサギを拘束装置にしっかりと固定したので、7〜13 mmの皮下ストレートピン電極を頭皮に挿入します(図1A)。45°の角度アプローチで、ワイヤーを耳の間に通し、リード線の配置を維持するために、ワイヤーをヘッドの後ろの拘束具に緩くつなぎます。5 本の EEG リード線を次の位置に配置します: 右前方、左前方、右後頭部、左後頭部、および他の 4 本のリード線の間の点に中央基準 (Cz) リード線を配置します (図 2D).
   手記：電極は、頭蓋骨に対して皮下組織に配置されると、適切に配置されます。この配置により、鼻、耳、その他の周囲の筋肉からのアーチファクトが最小限に抑えられます。リズミカルな鼻の動きによるアーティファクトは避けられません。前方のEEGリード線は、ウサギの目の内側に配置し、前方を指す必要があります。後頭部のリード線は耳の前方に配置し、内側を向く必要があります。Czは、4つの電極すべての間(ラムダとブレグマの中間、縫合線に沿って)の頭頂部の中央に配置されます。Cz電極のピンは前方を向いています。
   1. うさぎがワイヤーを噛もうとしないように、EEGワイヤーを耳の間に通します。
10. パルスオキシメータプレチスモグラフをウサギの耳の辺縁静脈に取り付けます.
    手記：信号を改善するために耳の余分な髪を剃ったり、センサーを所定の位置に保持するためにガーゼを使用したりする必要がある場合があります。
    1. プレチスモグラフィーの心拍数がECGからの心拍数と相関していること、および酸素飽和度が表示されていることを確認します(図3C)。
11. カプノグラフィーチューブ付きのフェイスマスクをウサギの口と鼻にそっと置きます(図2H)。マスクに紐を巻き付けてフェイスマスクを固定し、紐の両端を拘束具に取り付けます。カプノグラフィーチューブのもう一方の端をバイタルサインモニターに取り付けます.
    手記：実験中に紐がウサギの目の上に重ならないようにすることが重要です。これを行うには、ウサギの耳の間の拘束具の中央にひもをテープで固定します。カプノグラフィー信号を改善するには、テープと薄いニトリル片を使用して一方向弁を作成し、酸素がTピースに入るのを可能にし、吐き出されたCO2をカプノグラフィーチューブに導きます(図2I)。

2. ビデオ脳波-心電図の記録

1. 市販の脳波ソフトを使用してvideo-EEG-ECG記録を行います.
   手記：生体電位リードとビデオは、後で電気信号とビデオ信号を相関させるためにタイムロックされます(例:ミオクローヌスジャークによるEEGスパイク)。
2. ベースラインドリフト、60Hzの電気ノイズ、高い信号対雑音比で、最適な接続性を確認します。具体的には、心電図で心電図の各位相を視覚化できること、およびデルタ波、シータ波、アルファ波が脳波の高周波ノイズによって視覚的に隠されていないことを確認します。
   1. すべての電極で過剰なノイズが発生している場合は、中央のリファレンスリードを調整します。1つの電極だけが過度にノイズが多い場合は、その電極を皮膚の奥深くに押し込むか、金属が露出しなくなるまで位置を変えます。
3. すべてのウサギが同時に見えるようにビデオを調整し、運動活動と脳波所見との相関を可能にします(図3A).
   手記： このシステムは、最大7匹のウサギからの脳波/ECG/酸素濃度計/カプノグラフィーの同時記録に対応します。
4. 各動物から最低10〜20分間、または心拍数が落ち着いたリラックス状態(200〜250 bpm)に安定し、ウサギが少なくとも5分間大きな動きを示さなくなるまで、ベースライン記録を開始します。データをより見やすくするために、低周波フィルター(=ハイパスフィルター)を1Hzに設定し、高周波フィルター(=ローパスフィルター)を59Hzに設定します
   手記：ウサギがリラックスしていることを示す別の兆候は、脳波睡眠紡錘体の発症です(後述)。
5. 実験中にタイムロックされたメモをリアルタイムで追加して、介入(薬物送達など)と神経心イベント(脳波スパイク、運動発作、異所性心拍、不整脈など)のタイミング、および運動/研究者のアーティファクトを示します
   手記：研究者が介入(光刺激、薬物送達など)を適用する必要がある頻度のため、研究者が部屋に出入りし、ドアを開閉するストレスを最小限に抑えるために、研究者は実験中ずっと部屋の反対側に留まります。調査員は動物からできるだけ離れて座り、動物を邪魔する可能性を最小限に抑えるためにじっと静かにしています。

結果

図1:脳波電極とECG電極の写真。(A)曲がったECG電極とまっすぐなEEG電極。(B)ECG電極をウサギの皮下組織に引っ掛けて、貫通させる方法。略語(LL:左肢、RA:右腕、RL:右肢、LA:左腕、RF:右前頭、LF:左前頭、Cz:中枢、RO:右後頭部、LO:左後頭部)。

図2:機器に接続されたウサギ。(A)ECG電極の位置、左腕は黄色の点で示されています。右腕は白い点で示されています。左脚は赤い...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コンピュータ	谷間	オプティプレックス 5040	データ収集用コンピュータ
ECG電極	リズムリンク	RLSND116-2.5	13mm 35°曲げ(直径0.4mm)皮下ピン電極
EEG電極	リズムリンク	RLSP513	5ツイスト13mmストレート(直径0.4mm)皮下ピン電極
EEGLAB(2020年)	Swartz Center for Computational Neuroscience(スワーツ計算神経科学センター)	オープンアクセス	脳波のスペクトル解析が可能
イーサネット/イーサネット・アダプター	リンクシス	USB3G16	カメラをコンピューターに接続するためのアダプター
フォームパッド	ジェネリック	該当なし	首の圧迫による心肺への悪影響を防ぐために、拘束具によって小さなウサギの首に加えられる圧力を軽減し
MATLAB (R2019b、アップデート 5)	MathWorksの	該当なし	EEGLABの実行に必要
マイク	ソニーステレオ	ECM-D570Pの	発作の可聴症状の記録
マイクロポア医療用テープ、紙、ホワイト	3メートル	1530年1	ワイヤーを固定し、イヤースプリントを作成するために使用されます
ナタスニューロワークス	ナトゥス	LC101-8	取得およびレビューソフトウェア
光刺激装置	草	PS22	光パルスの周波数、遅延、持続時間、強度を制御する刺激装置
プラスチックワイヤーオーガナイザー/バンドラー	12Vwire.com	LM-12-100-BLKの	ノイズを低減するためのワイヤーの束ね
PS 22 光刺激装置	グラスインストゥルメント	BZA641035	フラッシュ周波数、遅延、強度を調整できるストロボライト
PVCパイプ	ジェネリック	該当なし	小さなウサギが後ろ足を蹴って脊髄損傷を引き起こすのを防ぎます
ウサギの拘束具	プラスラボ	501-TC	この研究では、6インチ x 18インチ x 6インチ
ラバーパッド(ブースター)	ジェネリック	該当なし	小さなウサギをレストレインで持ち上げて、首の圧迫を防ぎます
SpO2イヤークリップ	ノニン	61000	ピュアSAT/SpO2
SpO2センサーアダプター	ノニン	13931	XPODピュアSAT / SpO2
Webcol アルコール調製、滅菌、大型、2層	コヴィディエン	5110	カテーテル挿入前に耳の静脈を準備するには
LabChart Pro(2019、バージョン8.1.16)	ADInstruments	該当なし	ECG分析
量子増幅器	ナトゥス	13926	アンプ/デジタイザ
クォンタムヘッドボックスアンプ	ナトゥス	22134	64ピンブレークアウトボックス
SRG-X120 1080p PTZカメラ、HDMI、IP、3G-SDI出力付き	ソニー	SRG-X120	インペラカメラ