出典:Bascuas, T., et al. Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy. J. Vis. Exp. (2021).
このビデオでは、ウサギモデルから眼の色素上皮細胞を取得する手順を示しています。これらの細胞は、網膜変性疾患の治療戦略の開発に役立ちます。
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方法論記事
IPEおよびRPE細胞の単離:ウサギの眼から眼の色素上皮細胞を得るための技術
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
ニュージーランドの白ウサギは、0.9%NaClで希釈したペントバルビタール(150mg / kg)の過剰摂取により安楽死させ、腹腔内注射を行い、犠牲の直後に眼球を摘出しました。
1. 準備前
- 完全な培地(DMEM/Ham's F12に10%ウシ胎児血清(FBS)、80 U/mLペニシリン/80 μg/mLストレプトマイシン、および2.5 μg/mLアムホテリシンBを添加)を調製します。培地、1x PBS、および0.25%トリプシン(必要な場合)を37°Cのウォーターバスで加熱します。
- 滅菌ドレープをフードに入れて、無菌作業場所を準備します。フード内に必要なすべての滅菌器具と材料を導入します.
手記：眼の摘出術と残りの筋肉組織と皮膚の洗浄のみがフードの外側で行われる手順であり、残りの手順はフード内で実行する必要があります。
2. ウサギPE細胞の単離
- 湾曲したハサミとColibri鉗子を使用して、動物を安楽死させた後、目を摘出します。ハサミと鉗子(非滅菌)を使用して、目に残っている筋肉組織と皮膚をきれいにします
手記：眼球の摘出と洗浄に使用されるハサミと鉗子のサイズは、種によって異なります(たとえば、ラットとマウスの場合、器具は豚や牛に使用されるものよりも小さくなります)(図1を参照)。- 非滅菌PBSで満たされた50mLチューブに眼を採取し、チューブを層流フードに移します。ヨウ素ベースの溶液に2分間浸して目を消毒し、滅菌PBSで満たされたペトリ皿に移します。
- 電球の開口部
- 片目を滅菌ガーゼ湿布に置き、視神経にしっかりと近づけます。メス#11とハサミでリンバス下約2mmのところから目を開けます。前眼部(角膜、水晶体、虹彩)を取り出し、ペトリ皿に入れます。RPE細胞が分離されるまで、球根を硝子体のままにします。
- IPE細胞の単離
- レンズを取り外し、細かい鉗子でIPE細胞を含む虹彩を繊細に引き出します。虹彩をペトリ皿に入れ、滅菌PBSで洗い、さらに虹彩が準備されるまでPBSに入れておきます。メス#10で切って、虹彩から毛様体を取り除きます。
- 2つの虹彩を調製した後、0.25%トリプシン1mLと37°Cで10分間インキュベートし、この間にRPE細胞を単離することができる(ステップ2.4を参照のこと)。トリプシンを取り出し、1 mLの完全培地を虹彩に加え、平らなファイヤーポリッシュされたパスツールピペットで慎重に引っ掻いて細胞を分離します。ピペッティングで細胞を慎重に再懸濁し、細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移します。細胞懸濁液10μLを取ってトリパンブルーで1:3に希釈し、ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントします。
- すぐにトランスフェクションしない場合は、24ウェルプレート(100,000細胞/cm2)に200,000細胞/ウェルを1 mLの完全培地(10% FBS)で播種します(播種については表1を参照)。プレートをインキュベーターに入れ、37°C、5%CO2.
で培養します 手記：播種に十分な細胞を持つために、いくつかの目を一緒にプールする必要があるかもしれません。
- RPE細胞の単離
- 細い鉗子で後部から硝子体液と網膜を取り除きます。網膜色素上皮の損傷を避けてください。.
- 滅菌ガーゼを12ウェルプレートに入れ、電球をガーゼの上に置きます。
- PBSで洗ってください。片眼あたり0.25%トリプシンを50μL加え、37°Cで10分間インキュベートします。トリプシンを除去し、グローブあたり150μLの完全な培地を加え、湾曲したファイヤーポリッシュパスツールピペットでRPE細胞を繊細にこすり落とします。細い鉗子を使用して組織を固定します。細胞懸濁液を採取し、1.5mLのチューブに入れます。細胞懸濁液10μLを摂取します。トリパンブルーで1:4に希釈して、ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントします。
- 細胞を120 x gで10分間遠心分離します。
- すぐにトランスフェクションしない場合は、24ウェルプレート(100,000細胞/cm2)に200,000細胞/ウェルを1 mLの完全培地(10% FBS)で播種します(播種については表1を参照)。プレートをインキュベーターに入れ、37°C、5%CO2.
で培養します 手記：播種に十分な細胞を持つために、いくつかの目を一緒にプールする必要があるかもしれません。
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結果
| 種 | トリプシン治療 | N° IPE細胞 | N° RPE細胞 | 播種用プレート(100,000細胞/cm2) |
| 兎 | はい | ~350,000円 | ~2,500,000 | 24ウェルプレート |
表1:ウサギの眼から単離された初代PE細胞の数。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 12ウェルプレート | コーニング | 353043 | |
| 24ウェルプレート | コーニング | 353047 | |
| ベタジン | ムンディファーマ | ||
| ボンマイクロ鉗子フラット | |||
| Colibri鉗子(滅菌) | |||
| DMEM/ハムのF12 | シグマ・アルドリッチ | D8062 | |
| ドレープ(滅菌) | メルンリッケ・ヘルスケア | 800530 | |
| FBSの | ブルンシュヴィッヒ | 品番40-37500 | |
| 鉗子(サイズ違い)(滅菌) | |||
| ガーゼ圧縮 | プロメディカルAG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | ラボラトリアム Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| ノイバウアーチャンバー | マリエンフェルド・スーペリア | 640010 | |
| パスツールピペット(ファイヤーポリッシュ) | ウィテグ | 4100150 | |
| PBSの1X | シグマ・アルドリッチ | D8537 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | シグマ・アルドリッチ | P0781-100 | |
| ペントバルビタール(チオペンタール・インレサ) | オスペダリアAG | 31408025 | |
| ペトリ皿 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 150288 | |
| スカーペルNo.10 | スワン・モートン | 501 | |
| スカーペルNo.11 | スワン・モートン | 503 | |
| 鋭利な先端湾曲の極細ボンハサミ(滅菌) | |||
| シャープシャープチップストレート 極細ボンハサミ(滅菌) | |||
| トリプシン0.25% | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25050014 | |
| バンナススプリングハサミ湾曲(滅菌) |
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