IPEおよびRPE細胞の単離:単離されたブタの眼から色素性上皮細胞を取得する技術

要約

出典:Bascuas T. et al., Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、ブタの眼から虹彩と網膜色素上皮細胞を分離し、in vivoおよびex vivo研究のための一次培養物を取得する技術について説明します。これらの色素細胞は、眼疾患を治療するための再生アプローチを研究するために遺伝子組み換えされる可能性があります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 準備前

1. 完全な培地(DMEM/Ham's F12に10%ウシ胎児血清(FBS)、80 U/mLペニシリン/80 μg/mLストレプトマイシン、および2.5 μg/mLアムホテリシンBを添加)を調製します。培地、1x PBS、および0.25%トリプシン(必要な場合)を37°Cのウォーターバスで加熱します。
2. 滅菌ドレープをフードに入れて、無菌作業場所を準備します。フード内に必要なすべての滅菌器具と材料を導入します.
   注:目の除核と残りの筋肉組織と皮膚の洗浄のみがフードの外側で行われる手順であり、残りの手順はフード内で実行する必要があります。
3. ブタの目は、犠牲から6時間以内に地元の食肉処理場から採取され、氷の上で実験室に運ばれました

2. ブタのPE細胞の単離

1. 湾曲したハサミとColibri鉗子を使用して、動物を安楽死させた後、目を摘出します。ハサミと鉗子(非滅菌)を使用して、目に残っている筋肉組織と皮膚をきれいにします
   手記： 眼球の摘出と洗浄に使用されるハサミと鉗子のサイズは、種によって異なります(たとえば、ラットとマウスの場合、器具は豚や牛に使用されるものよりも小さくなります)(図1を参照)。
   1. 非滅菌PBSで満たされた50mLチューブに眼を採取し、チューブを層流フードに移します。ヨウ素ベースの溶液に2分間浸して目を消毒し、滅菌PBSで満たされたペトリ皿に移します。
   2. 滅菌済みのペトリ皿に目を移した後、Colibriまたは先のとがった鉗子で片方を視神経にしっかりと近づけます。虹彩の限界近く(扁平部とオラセラータの間)に18Gの針で穴を開けます。穴に小さなハサミを差し込み、虹彩の周りをカットします。前眼部(角膜、水晶体、虹彩)を取り出し、ペトリ皿に入れます。RPE細胞が分離されるまで、球根を硝子体のままにします。

3. IPE細胞の単離

1. メス#10で切って、虹彩から毛様体を取り除きます。2つの虹彩を調製した後、1 mLの完全培地を加え、平らなファイヤーポリッシュしたパスツールピペットで慎重に引っ掻いて細胞を分離します。細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。細胞懸濁液10μLを取ってトリパンブルーで1:4に希釈し、ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントします。
2. すぐにトランスフェクションしない場合は、24ウェルプレート(100,000細胞/cm²)に200,000細胞/ウェルを1 mLの完全培地(10% FBS)で播種します(播種については表1を参照)。プレートをインキュベーターに入れ、37°C、5%CO₂.
   で培養します 手記：播種に十分な細胞を持つために、いくつかの目を一緒にプールする必要があるかもしれません。

4. RPE細胞の単離

1. 手順 1.1.1 を実行します。電球をペトリ皿に入れ、PBSで洗います。球根に1mLの完全な培地を入れます。
2. 湾曲したファイヤーポリッシュされたパスツールピペットを使用して、RPE細胞を慎重に取り除きます。脈絡膜-ブルッフ膜複合体が滑り落ちないように、下から上にこすり落とすようにしてください。1,000 μLピペットを使用して球根内の細胞懸濁液を回収し、1.5 mLチューブに移して再懸濁します。細胞懸濁液10 μLを取り出し、トリパンブルーで1:8に希釈して、ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントします。
3. ステップ3.2で説明したように細胞をシードします。

結果

種	トリプシン治療	N° IPE細胞	N° RPE細胞	播種用プレート(100,000細胞/cm2)
豚	いいえ	~100万人	~3,000,000	24ウェルプレート

>表1:異なるnt種の眼から単離された初代PE細胞の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12ウェルプレート	コーニング	353043
24ウェルプレート	コーニング	353047
ベタジン	ムンディファーマ
ボンマイクロ鉗子フラット
Colibri鉗子(滅菌)
DMEM/ハムのF12	シグマ・アルドリッチ	D8062
FBSの	ブルンシュヴィッヒ	品番40-37500
鉗子(異なるサイズ)(滅菌)
NaCl (0.9%)	ラボラトリアム Dr. Bichsel AG	1000090
ニードル(18G)	テルモ	テルNN1838R
ノイバウアーチャンバー	マリエンフェルド・スーペリア	640010
パスツールピペット(ファイヤーポリッシュ)	ウィテグ	4100150
PBSの1X	シグマ・アルドリッチ	D8537
ペニシリン/ストレプトマイシン	シグマ・アルドリッチ	P0781-100
ペトリ皿	サーモフィッシャーサイエンティフィック	150288
スカーペルNo.10	スワン・モートン	501
スカーペルNo.11	スワン・モートン	503
鋭利な先端湾曲の極細ボンハサミ(滅菌)
シャープシャープチップストレート 極細ボンハサミ(滅菌)
Tali画像処理サイトメーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	T10796
トリプシン0.25%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25050014
トリプシン5%/ EDTA2%	シグマ・アルドリッチ	T4174
バンナススプリングハサミ湾曲(滅菌)

名 名