細菌性角膜炎のブタex vivo角膜モデル:角膜上皮細胞における細菌感染を確立する技術

要約

出典:Okurowska, K., et al. 細菌性角膜炎に対する薬物治療を研究するためのブタのEx Vivo Corneaモデルの確立。 J. Vis. Exp (2020).

このビデオでは、ブタの眼から解剖した角膜強膜ボタンを使用して細菌性角膜炎のex vivoモデルを設定するプロトコルについて説明しています。接種された細菌は、角膜上皮切開部を横切って下にある間質に侵入し、in vivo感染を模倣する角膜組織内で感染を確立します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています

1. 接種材料の準備

1. 10 mLのLBブロスをフォームストッパー付きの50 mLコニカルフラスコに注ぎます。
2. 緑膿菌PAO1株またはPA14株のコロニーを新鮮な寒天プレートから移し、細菌が中盤の対数期になるまで37°Cで3〜4時間インキュベー
トします。
3. 細菌の培養物を50mLチューブに移し、3,000 x gで5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットをPBSに再懸濁します。
4. 手順1.3をさらに2回繰り返して、細胞を洗浄します。細胞ペレットをPBSに再懸濁し、滅菌PBSをブランクとして使用して、600 nmの光学密度を約0.6に調整します。

2. 角膜強膜ボタンへの感染

1. ペトリ皿から培地を取り出し、1 mLの滅菌PBSで角膜を2回すすぎます。.
2. 角膜を間に挟みながら鉗子をやさしく握ります。10Aメスを使用して、角膜強膜ボタンの中央部分に4つのカット(垂直に2つ、水平に2つ)を上皮層から下層間質まで行います。
3. 滅菌ガラス型を幅広の部分を上にして6ウェルプレートに置き、角膜をガラス型の中央に置き、上皮側を下に向けて置きます。ガラス型の底部分の中央に切り込みを入れます。
4. 重要なステップ:DMEMに溶解した1%(w / v)低融点寒天を1mL注ぎ、ガラス型に角膜を完全に充填します。
5. 寒天を固めてから、角膜上皮が上を向くようにガラス型を反転させます。
6. OD_600nm = 0.6 の細菌培養物 15 μL (緑膿菌の場合、これは 15 μL 中の約 1 x 10⁷ コロニー形成単位 (CFU) に相当) を切断領域に直接ピペットで入れ、次に 85 μL の PBS を上部に追加して角膜上皮を湿らせます。残りの細菌培養物とプレートを寒天で希釈して、接種のコロニー形成単位をカウントします。
7. 抗生物質を含まないDMEM1 mLをガラス型で各ウェルの底に加えます。感染した角膜強膜ボタンを含む6ウェルプレートを、加湿インキュベーター内で37°C、5%_CO2で最大24時間インキュベー
トします。
8. すべての実験と並行して、感染していないコントロール角膜を設定します。非感染コントロールを設定するには、ステップ2.6の15μLの細菌培養物を滅菌PBSに置き換えてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
50 mL ファルコンチューブ	SLSの	352070
アムホテリシンB	シグマ	A2942(英語版)
Cellstar 12ウェルプレート	グライナーバイオワン	665180
デキストラン	シグマ	31425-100mg-F
ディステル	フィッシャーサイエンティフィック	12899357
DMEM + グルタマックス	SLSの	D0819
デュアルオーブンインキュベーター	SLSの	OVe1020	滅菌オーブン
上皮成長因子	SLSの	E5036-200UG
F12ハム	シグマ	N4888
子牛胎児血清	ラボテックインターナショナル	CA-115/500
鉗子	フィッシャーサイエンティフィック	15307805
ヘラセル VIOS 160i	サーモサイエンティフィック	15373212	組織培養インキュベーター
インスリン、組換えヒト	SLSの	91077C-1Gの
LB寒天	シグマ	L2897
マルチトロン	インフォラー	適用できません	細菌インキュベーター
PBSの	SLSの	P4417
ペニシリン-ストレプトマイシン	SLSの	P0781
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィック	12664785
ペトリ皿 35x10mm CytoOne	スターラブ	CC7672-3340
ポビドンヨウ素	ウェルドリックス薬局	2122828
セーフ 2020	フィッシャーサイエンティフィック	1284804	クラス II微生物学用安全キャビネット
メス刃数15	フィッシャーサイエンティフィック	O305
メススワンモートン	フィッシャーサイエンティフィック	11849002

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