バイオフィルムのEx vivoブタ肺モデル:ブタ気管支組織上の細菌バイオフィルムを研究するための肺モデルを開発する技術

要約

出典:Harrington, N.E. et al., Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、感染した細気管支組織上の細菌バイオフィルムのex vivoブタ肺モデルを開発するためのプロトコルについて説明しています。バイオフィルムは、表面に付着したマトリックスに埋め込まれた細菌の凝集体です。このモデルは、バイオフィルム形成のさまざまな段階で細菌の抗生物質感受性を研究するために使用されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ex vivo pig lung (EVPL) 組織の解剖と感染

1. EVPL組織で使用するSCFMを作製するには、表1に示す1 L修飾SCFMのレシピに従ってください。
2. 解剖する前に、緑膿菌/黄色ブドウ球菌の実験室で標準的である寒天(例:リソジェニーブロス+ 1.2%寒天)を使用して、感染に必要な細菌株の寒天プレートを準備します。
3. 実験に必要なブタ細気管支組織片の数を計算します。これには、感染していない対照組織片も含まれます。この数値に 2 を掛けて、2 つの反復肺で実験を繰り返し、結果の再現性を確認します。
4. 必要なティッシュピースの総数に0.5を掛けて、アガロースパッドを作るために必要なSCFMアガロースの量(mL)を決定し、400μL/ティッシュピースに十分な培地と、調製中のピペッティングエラーや蒸発を考慮した予備のSCFM寒天
培地を作ります。
5. 0.8% 重量/容量のアガロースで所望の総容量の SCFM を作るために必要な SCFM 15 mL ごとに 0.12 g のアガロースを添加します。
6. アガロースが完全に溶解するまでSCFMアガロース溶液を加熱します。低電力の家庭用電子レンジをお勧めします。必要な時間はワットによって異なりますtag電子レンジのe。アガロースを約50°Cまで冷まします(手触りは温かく、持ちやすいです)。これ以上冷まさないでください。
7. ピペットを使用して、必要なティッシュピース1枚につき400μLのSCFMアガロースを24ウェルプレートの1ウェルに加えます。
8. SCFMアガロース含有24ウェルプレート/秒を紫外線下で10分間滅菌します。
9. 20 mLの滅菌ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と20 mLの滅菌ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640に50 μg/mLのアンピシリンを添加して、解剖するすべての無傷の肺に対して3回の反復洗浄液を準備します。
10. 解剖されるすべての無傷の肺の最終洗浄として40mLのSCFMのアリコートを作ります。すべての洗浄液は、4°Cで一晩保存することも、すぐに使用することもできます。
11. 屠殺後できるだけ早く指定された供給源から肺を入手し、家庭用のクーラーボックスで実験室に輸送することにより、肺が冷たく保たれるようにします><。 手記：屠殺日に近いほど、保管による打撲傷が少なくなりますが、屠殺から最大4日間冷蔵保存された組織も使用できます。冷蔵ボックスは肉屋や食肉処理場に持ち込む必要があるため、使用後は毎回地元の研究所のガイドラインに従って除染し、使用しないときは微生物学研究所の外に保管して、汚染や封じ込め違反のリスクを減らす必要があります。
12. 滅菌された表面で炎の下で作業し、オートクレーブ処理されたアルミホイルで覆われた清潔なプラスチック製のまな板の上に肺を置きます。細気管支が無傷のままであることを確認してください。食肉処理場や輸送中に損傷があった場合、肺は使用に適していません。
13. パレットナイフを炎の下で加熱し、細気管支の周囲の肺の領域にナイフを非常に短時間触れて、組織の表面を滅菌します。
14. 滅菌されたカミソリの刃を使用して、細気管支を囲む表面組織を切り取ります。損傷を防ぐために、細気管支と平行に切開を行います。
15. 細気管支が露出したら、細気管支を解放するために、見える最高点で細気管支を通して断面切開を行います。
16. 滅菌鉗子を使用して、細気管支の自由端を軽く保持し、滅菌されたかみそりの刃を使用して残っている不要な組織を切り取ります。肺から細気管支を取り除くために枝分かれが見える前に、細気管支を横切って最終的な断面切開を行います。
17. 細気管支を最初のDMEM / RPMI 1640洗浄に入れます。.細気管支を洗浄したままにし、手順1.12〜1.15を繰り返して、計画された実験に十分な組織切片を生成するために必要な同じ肺から細気管支の追加切片を採取します。.
18. 同じ肺からの追加の細気管支切片を洗浄液に入れます(ステップ1.17)。洗濯物に2分以上置いておきます。
19. 最初のDMEM / RPMI 1640洗浄から細気管支を取り出し、サンプルを滅菌ペトリ皿に入れます。.
20. 滅菌鉗子を使用して各細気管支を軽く保持し、組織に損傷を与えないように注意してください。残っている軟部組織をできるだけ取り除き、滅菌解剖ハサミを使用して組織を~5mm幅に切断します。
21. すべての細気管支組織ストリップを2回目のDMEM / RPMI 1640洗浄に入れます。.洗濯物に2分以上置いておきます。
22. 滅菌鉗子を使用して、組織を傷つけないように注意しながら、2回目の洗浄からティッシュストリップを取り外します。ティッシュを清潔で滅菌済みのペトリ皿に入れます。
23. 細気管支に付着している残りの軟部組織をすべて取り除き、滅菌解剖ハサミを使用してストリップを正方形(~5 mm x 5 mm)に切断します。
24. 3番目のDMEM / RPMI 1640ウォッシュをペトリ皿に加えます。皿を回して、ウォッシュでティッシュピースを軽く混ぜます。
25. ティッシュ片を取り除かずに、3回目のウォッシュをペトリ皿から注ぎます。
26. ティッシュを含むシャーレに最終的なSCFMウォッシュを追加し、すべてのティッシュピースが覆われていることを確認します。
27. SCFMで組織片をUV光の下で5分間滅菌します。
28. 滅菌鉗子を使用して、滅菌した各細気管支組織片を、SCFMアガロースパッドを含む24ウェルプレートの個々のウェルに移します。
29. 各組織片を目的の細菌株に感染させるには、寒天プレートで成長したコロニーに触れ、滅菌済みの0.5mLインスリンシリンジに取り付けた29G針の先端に触れます。次に、コロニーをティッシュピースに触れ、ティッシュ表面を優しく刺します
    手記：29Gの針を備えたインスリン注射器を使用すると、針と肺組織の両方から指を安全な距離に保ちながら、針を正確かつ快適に保持できます。シリンジに取り付けられていない29Gの針を使用してこの手順を実行することは可能ですが、これにはより器用な技術が必要であり、針刺し損傷のリスクが高まります。インスリン注射器は簡単に入手できます。
30. 感染していないコントロールの場合は、滅菌した0.5 mLインスリン注射器に取り付けた29 G針の先端で、各組織片の表面をそっと刺します。.
31. ピペットを使用して、各ウェルに500μLのSCFMを追加します。
32. 各24ウェルプレートの通気性のあるシーリングメンブレンを紫外線で10分間滅菌します(材料表)。
33. 24ウェルプレートから蓋を取り外し、通気性のあるメンブレンと交換します。
34. プレートを37°Cで、振とうせずに所望のインキュベーション(感染)時間だけインキュベートします。未感染のコントロールピースに接種された病原体の目に見える成長がないことを確認します(汚染管理).
    手記：必要に応じて、アンピシリンをSCFMアガロースパッドに添加し、ステップ1.31でSCFMを覆い、最終濃度を20μg/mLにすることができます。これにより、緑膿菌や黄色ブドウ球菌の増殖に影響を与えることなく、肺上のほとんどの内因性細菌の増殖が抑制されますが、アンピシリンの存在が他の抗生物質に対する感受性に影響を与える可能性があるため、読者はテストしたい株や抗生物質に応じてこの選択をすることになります。

表 1

1. ex vivoブタ肺モデルで使用するための合成CF喀痰培地(SCFM)の調製

作成したら、SCFMはフィルター滅菌され、その後、4°Cで最大1か月間保存できます。

の 必要に応じてます メートル

>a) メインレシピ
ステップ1	ケミカル	量	指示	1L SCFMでの最終mM
	NaCl	3.03 グラム	SCFMの準備にのみ使用される、きれいなボトルに塩と水を追加します	51円85銭
	KClの	1.114グラム		14円94銭
	dH2O(ディH2O)	640ミリリットル		該当なし
ステップ2	ケミカル	水で作られ、フィルター滅菌され、4°Cで保存されたストックのモル濃度	指示	1L SCFMでの最終mM
	Na2HPO4	0.125メートル	ステップ1で準備した塩と水に各ストック10mlを追加します	1.25
	NaH2PO4	0.13メートル		1.30
	NH4CLの	0.228メートル		2.28
	ノイ3	0.0348メートル		0.35
	K2SO4	0.0271メートル		0.27
	モップ	1メートル		10:00
ステップ3	ケミカル		指示	1L SCFMでの最終mM
	19 セクションbに従って調製したアミノ酸溶液		ステップ1と2で調製した溶液に各ストック10mlを加えます。	セクションbを参照)
ステップ4	化学		指示	1L SCFMでの最終mM
	HClまたはNaOH		ステップ1-3から6.8で調製した溶液のpHを調整するために使用します。記録的な量の酸/塩基の添加量。	該当なし
ステップ5	化学		指示	1L SCFMでの最終mM
	dH2O		ステップ1〜4で調製した溶液に、最終容量960mlまで加えます	該当なし
ステップ6	ケミカル	水で作られ、フィルター滅菌され、4°Cで保存されたストックのモル濃度	指示	1L SCFMでの最終mM
	CaCl2	0.175メートル	ステップ1〜5で調製した溶液に各ストックを10ml加え	1.75
	MgCl2	0.0606		0.61
ステップ7	ケミカル	水で作られ、フィルター滅菌され、4°Cで保存されたストックのモル濃度	指示	1L SCFMでの最終mM
	L-乳酸	0.93メートル	5M NaOHを含むpH7の水にストックします。ステップ1〜6で調製した溶液に10mlを加えます。	9.30
ステップ8	ケミカル	レシピに加える直前に、水で作られたワーキングストックのモル濃度	指示	1L SCFMでの最終mM
	鉄(III)SO4.7H2O	0.00036メートル	0.036 Mのマスターストックを作成し、溶液に沈殿物がない限り、フィルター滅菌して4°Cで保存することができます。ワーキングストックを作製するには、110 μlのマスターストックを9.890 mLのdH2Oに加え、ステップ1〜7で調製した溶液にワーキングストックを加えます。	0.0036

名 % します。 名 します。 % % 名 名 します。 %

>b) アミノ酸ストックの調製; 使用前にフィルター滅菌を行い、4°Cで保存してください。
アミノ酸	mM株	指示	1 L SCFMの最終mM
アラニン	178	水に溶かします	1.780
アルギニン	30.6	水に溶かします	0.306
アスパラギン酸	82.7	0.5 M NaOHに溶解	0.827
システイン	16	水に溶かします	0.160
グルタミン酸	154.9	1 M HClに溶解	1.549
グリシン	120.3	水に溶かします	1.203
ヒスチジン	51.9	水に溶かします	0.519
イソロイシン	112.1	シェーカーで50°Cに30分間加熱して水に溶かします	1.121
ロイシン	160.9	水に溶かします	1.609
リジン	212.8	水に溶かします	2.128
メチオニン	63.3	水に溶かします	0.633
オルニチン-HCl	67.6	水に溶かします	0.676
フェニルアラニン	53	水に溶かします	0.530
プロリン	166	水に溶かします	1.660
セリン	144.6	水に溶かします	1.446
トレオニン	107.2	水に溶かします	1.072
トリプトファン	1.3	0.2 M NaOHに溶解	0.013
チロシン	80.2	1M NaOHに溶解	0.802
バリン	111.7	水に溶かします	1.117

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
インスリン注射器 - 0.5 mL、29Gの針が付いています。	VWRの	BDAM324892
24ウェル培養プレート
70%エタノールまたは類似のもの、表面滅菌および解剖装置の燃焼用
P. aeruginosa/S. aureusの縞を調製するための寒天プレート(任意の適切な培地)
アガロース
オートクレーブ滅菌済みのアルミホイルで、肺を解剖するまな板を覆います。
Breathe-easyまたはBreathe-easyシーリングメンブレン(マルチウェルプレート用	ダイバーシファイド・バイオテック	BEM-1 または BERM-2000
ブンゼンバーナー
まな板 - アルコールで簡単に除染できるように、プラスチック板をお勧めします。
肺を研究室に運ぶためのCoolbox
さまざまなサイズの解剖はさみ
ダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)
大型パレットナイフ
マウントされたカミソリの刃
ペトリ皿
プラスチック製のまな板とアルミホイルにより、無菌で洗浄可能な解剖面を作成
ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640ミディアム
SCFM			表1に記載されている成分
鉗子の選択(鈍い先端を推奨)
汚染された鋭利物や豚の肺組織を廃棄するための適切な容器、機関の 健康と安全に関するポリシー。

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