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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 組織の解剖
- 非滅菌解剖ワークスペースを使用してブタ組織を調製します。
- 除核豚の目は、地元の食肉処理場、動物研究、またはベンダーから調達してください。配達中はPBSに沈められた氷に目を離さず、受け取ったらすぐに使用してください。
- 眼窩外組織を切り取り、結膜をトリミングして、角質強膜シェルと視神経のみを残します。解剖は、肉眼的解剖ツールパックに入った大きな手術用ハサミと鉗子を使用して、非滅菌条件下で行います。
- 実験のセットアップに必要なすべての目が予備的/肉眼的に解剖されるまで、氷上の新鮮なPBSに目を戻します。
- 密閉容器に眼を 10% ベタジン溶液に 2 分間浸し、BSC II キャビネット (キャビネット #1) に無菌的に移してマイクロダイセクションします。その後のすべての作業は無菌条件下で実行し、セットアップ中の汚染を最小限に抑えます。
- 前部を滅菌的に解剖します。
- ベタジン溶液で2分後、目を滅菌1x抗生物質-抗真菌剤-PBS(AA-PBS)の3回連続洗浄に移し、眼組織の無菌性を維持しながら眼表面から余分なベタジン溶液を取り除きます。.3回の洗浄後、さらに使用するまで組織をAA-PBSに保持します。
- カミソリの刃/メスと湾曲したハサミを使用して目を半角切除します。AA-PBSに浸したガーゼに目を置き、目の赤道近くに滅菌のかみそりの刃またはメスで切開を作成します(前面に40で60/40を分割)。湾曲した手術用ハサミを使用して、眼を半角化して前眼(角膜半分)を分離します。
手記： 前眼部の周りのカットは、臓器培養のセットアップ後に体液漏れを引き起こす強膜のギザギザの粗いエッジを防ぐために連続している必要があります。
- マイクロハサミをシャベルとして使用して、前眼部から硝子体液をすくい取ります。マイクロハサミを使用して前眼部からレンズを取り外します。AA-PBSの前部セグメントは、さらなる解剖ステップまで放置します.
手記：解剖されるすべての目は、このステップで保持することができ、残りの解剖プロセスを通じて1つずつ撮影することができます。
- 解剖顕微鏡を使用して、虹彩を虹彩の根元に徐々に、線維柱帯(TM)が見えるまで放射状に切り戻します。TMは、角膜強膜の殻の周りに円周方向に配向された繊維からなる色素組織です。虹彩の根元に向かって虹彩を慎重に切り込むと、組織の下のTMの深さが露出します。
- 組織への最初のカットと同じ深さで虹彩の周りを360°カットして、TM領域全体を露出させます。必要に応じて、TMを覆う残りの虹彩をクリーンアップします。
- TMの後方にある毛様体の残りの部分を切り取り、TM領域の後方(約1 mm)に組織の細いバンドのみを残します。
- 解剖した前眼部(AS)を培地に置き、ディッシュアセンブリBSC IIキャビネット(キャビネット#2)の前眼部臓器培養(ASOC)でさらにセットアップします。
手記：ASOCのセットアップ前に、1人のユーザーが解剖と臓器培養ディッシュの組み立てを行っている場合、この時点ですべての目を保持できます。