前眼部培養:豚眼の前部を有する角膜を培養する方法

要約

出典: Boice, E. N., Snider, E. J. Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance. J. Vis. Exp. (2021).

この動画では、ブタの眼から角膜を持つ前眼部の培養方法を実演します。この培養システムは、眼の損傷を研究するための実験モデルとして機能します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 臓器培養皿の前眼部の設定

1. ASを反転させた(カップアップ)ペトリ皿に単一の前部セグメント(AS)を置きます。綿棒を使用して、メディアで濡らし、角膜の中央を軽くたたいて色素を取り除きます。鉗子を使用して目を保持し、同じ綿棒を使用して、強膜の周りの綿棒を拭いて余分な色素を取り除きます。
2. ASを反転させ、皿の底部の上部に隆起した領域の上に置き、角膜を皿の隆起した領域の中央に置きます。clをamp新しく配置されたASの上にリング
を置きます。
3. 対応する穴に4本のネジを取り付けて、リングを所定の位置に保持し、ASをリングの下に固定します。Lキーでネジをそっと手で締めます.
   手記：締め付けステップは実験全体を通して毎日行われるため、ここでの最初の締め付けの目標は、クランプリングが壊れないようにしながら、メディアが漏れないようにすることです。
4. 滅菌ペトリ皿セットで、上部を皿の上に置き、セットアップを反転させます。ディッシュスタンドを取り付けます。Oリング付きの流体コネクタを皿底のネジ付きポートに取り付けます。
5. 1つの流体コネクタに、18 G 90°曲げニードルハブ、長さのチューブ、18 Gニードルハブ、ナイロンシリンジフィルター、三方弁、およびメディアで満たされた20 mLシリンジを取り付けます。
6. 2 番目の流体コネクタには、18 G 90° 曲げニードルハブ、チューブの長さ、18 G ニードルハブ、三方弁、および滅菌 10 mL シリンジのバレル部分を取り付けます (これは、ASOC からの液体と泡をキャッチするリザーバーとして機能します)。
7. シリンジに対して適切に開いた状態で、ステップ1.5で特定した流路系コネクタポートを使用してシステム内に媒体を静かに押し込み、ASを膨らませ、チューブ内の媒体を充填し、最終的にはリザーバーに充填します
   手記：メディアがASOCディッシュに漏れた場合、ASはクランプリングで十分にしっかりと固定されていません。
8. メディアを皿にそっと押し込み、皿を反転させて気泡をリザーバーに押し出して、気泡を取り除きます。
9. 皿を置き、直立させます。ペトリ皿の底部をスタンドの足の下に置き、チューブを巻き込まないように注意してください。

2. 前眼部臓器培養の開始

1. ASOCはインキュベーションの準備が整いました。ASOCディッシュを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO₂)に入れます。インキュベーター内の圧力トランスデューサーの上のASOCディッシュの高さが既知であり、考慮されていることを確認して、眼圧(IOP)を正確に計算します。
2. チューブラインを37°C、5%_CO2インキュベータードアの底から外に向け、ドアの開閉を妨げないようにします。20 mLシリンジを2.5 μL / minにセットしたシリンジポンプに取り付けます。
3. リザーバーのあるチューブラインを圧力トランスデューサー機器に配置します。ラインにPBSを流しながら、サイド3ウェイバルブを圧力トランスデューサのセットアップに接続して、チューブラインに気泡が入らないようにします
   手記：システムを設置した後、リザーバーからPBSを空にして、臓器培養期間中の微生物増殖によるリザーバー汚染の可能性を減らします。
4. まず、データファイルを保存するためのmicroSDカードが存在することを確認して、IOPデータ収集を開始します。次に、圧力トランスデューサのセットアップをオンにして、データ収集を開始します。

3. ASOCの日常メンテナンス

1. ASOCが平衡化するために24時間後、37°C、5%CO₂インキュベーターから皿を取り出し、バイオセーフティキャビネット(BSC)IIキャビネットに入れます><。 手記：圧力データの取得では、ASOCがインキュベーターから取り出され(高さの変更)、キャビネット内で調整されるため、これらの期間はスパイクのように見えます。
2. ペトリプレートの各皿の下に漏れがないか確認してください。存在する場合は、皿の下の流体接続がしっかりとしていることを確認し、必要に応じて再度締めます。滅菌Lキーを使用して、クランプリングのネジを締めるディッシュトップに漏れがないか確認します。
   手記：AS強膜組織は24時間圧縮され、厚さが減少するため、クランプリングを締める必要があります。
3. 皿からメディアをよく吸引します.
   手記：小柱メッシュワークは、ASOCに送り込まれる媒体から流体をろ過しています。したがって、メディアはASOCディッシュのエッジに沿って存在します。
4. 手順1.7と1.8を繰り返して、閉じ込められた気泡を取り除きます。
5. シリンジポンプでシリンジを補充し、シリンジポンプが作動していることを確認し、ASOCへの灌流のためのバルブの位置合わせを確認します。ASOCディッシュを37°C、5%_CO2インキュベーターに戻します.
   手記：最適な手順は、毎日実行する必要があります。ただし、開始容量 20 mL の培地、ASOC ディッシュウェル容量、および 2.5 μL/min のポンプ速度を使用すると、システムを数日間そのままに運転するのに十分です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10-32ポリカーボネートストレートプラグ、オスネジパイプコネクタ	マクマスター・カー	51525K431
10-32ソケットキャップネジ、1/2インチ	マクマスター・カー	92196A269
10 mLシリンジ	BDの	302995
20 mLシリンジ	BDの	302830
アンチアンチ	ギブコ	15240-096
ボールエンドLキー	マクマスター・カー	5020A25
BD Intramedic PE 160 チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-170-12E
綿棒	ピューリタン	25-8061WC
DMEMメディア	ATCCの	2002年30月
FBSの	ATCCの	2020年30月
細い鉗子	世界の精密機器	15914
グルタマックス	ギブコ	35050-061
高温シリコンOリング、幅2 mm、内径4 mm	マクマスター・カー	5233T47
ネイル(穿刺物)	マクマスター・カー	97808A503
ナイロンシリンジフィルター	漁夫	09-719C
PBSの	ギブコ	〒10010-023
ポリカーボネート製、三方、オス型ルアーロック付きストップコック	漁夫	NC9593742
ステンレス鋼18 G 90度角度ディスペンシングニードル	マクマスター・カー	75165A81
ステンレス鋼18Gストレート1/2 ''ディスペンス針	マクマスター・カー	75165A675

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