出典: Ou, Q. et. al., 生理学的条件下での豚の心臓のスライスと培養. J. Vis. Exp. (2020)
このビデオは、ブタの心臓の生存可能な超薄切片を生成するためのビブラートムベースの手順を示しています。調製した組織切片は培養し、薬理学的試験のモデルシステムとして使用することができます。
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方法論記事
ブタ心室スライスの生成:ブタ心臓組織の超薄スライスを調製するためのビブラトームベースの技術
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 豚の心臓組織スライス
- ビブラートにティッシュバスをセットし、ティッシュバス冷却ジャケットに氷を加え、次にティッシュバスにタイロード溶液を追加します。ティッシュバス冷却ジャケットから溶けた氷の処分を収集するために、1Lのプラスチックジャーをセットアップします。スライスするチロード溶液1Lについて、3 g / L 2,3-ブタンジオンモノキシム(BDM)、140 mM NaCl(8.18 g)、6 mM KCl(0.447 g)、10 mM D-グルコース(1.86 g)、10 mM HEPES(2.38 g)、1 mM MgCl2(1 M溶液1 mL)、1.8 mM CaCl2(1 M溶液1.8 mL)を混合します。 最大1 LのddH2O.NaOHを使用してpHを7.40に調整します。次に、1,000 mL、0.22 μmの真空フィルター/保存システムを使用して溶液をろ過し、4°Cで一晩保存します。
- バイオセーフティキャビネットの下で、豚の心臓を1Lの新鮮な冷たい心臓麻痺溶液が入ったトレイに移します。1 Lの心筋麻痺溶液に対して、110 mM NaCl(6.43 g)、1.2 mM CaCl2(1 M溶液1.2 mL)、16 mM KCl(1.19 g)、16 mM MgCl2(3.25 g)、10 mM NaHCO3(0.84 g)、1 U/mLヘパリン、最大1 LのddH2Oを混合します。次に、1,000 mL、0.22 μmの真空フィルター/保存システムを使用して溶液をろ過し、4°Cで一晩保存します
手記： スライスの日に心臓麻痺溶液に1,000 U / Lヘパリンを追加します。 - 心臓を解剖し、格納式の滅菌メスを使用して左心室を分離します。次に、かみそりの長方形の刃を使用して、左心室をそれぞれ1〜2 cm3のブロックに切断します。1つのピースをスライスに使用し、残りのピースを氷の上の冷たいタイロード溶液に入れた50 mLのチューブに入れて、後で必要に応じて切断します。
手記： 手でスライスする前にティッシュをマッサージしてください、特にこれが2番目のブロックの場合。マッサージは、正しい筋繊維の構成を回復させ、心臓ブロック内のこわばりを防ぐのに役立ちます。 - 1〜2滴の組織接着剤(Table of Materials)を金属サンプルホルダーに加え、表面積が約1 cm2の4%寒天ブロックの一部を貼り付けます。
- 寒天に1〜2滴の組織接着剤を加えます。
- 心臓心外膜側を下にして寒天に心臓ブロックを貼り付け、できるだけ平らであることを確認します。次に、ハートブロック付きのティッシュホルダーをビブラトームのスライスバス内の位置に移します。
- 酸素チューブをスライスバスに取り付け、スライスを収集するためのタイロード溶液で満たされた金属トレイ(酸素化されたタイロードバス)を取り付けます。次に、金属トレイに40μmのセルストレーナーを追加して、切断後のスライスを収集します。
- スライス位置の調整
- ビブラトーム操作ソフトウェアとダッシュボードを使用して、ブレード/サンプルの高さを調整します。高さボタンを選択し、画面の指示に従って高さを調整します。理想的には、ブレードを組織の上部に近づけ、乳頭筋の下に置き、スライスする前に組織とブレードを覆う液体があることを確認します。
- ティッシュのスライスを開始する位置を調整するには、アドバンスボタンを選択します。スライスボタンを押し、ノブを使用して速度を上げ、ブレードを組織の端に向かって動かします。次に、もう一度スライスを押して停止し、前進ボタンを押してプロセスを非アクティブにします。
- 切削パラメータを調整します:前進速度= 0.03 mm / s、振動周波数= 80 Hz、および水平振動振幅= 2 mm。次に、スライスボタンを選択してスライスを開始します。
- ビブラトームを組織の端に達するまでスライスしますが、標本ホルダーの後端に当たる前にスライスします。この時点で、もう一度sliceを押して停止します。戻るボタンを押すと、開始位置に戻ります。
- 自動リピート(2回クリック)を選択すると、振動ミクロトームが最大99回スライスプロセスを自動リピートできます。
- スライスの収集
- スライスが全長になり、見栄えが良くなるまで待ってから(乳頭筋層を通過した後)、スライスの収集を開始します。
- 冷たいタイロード溶液を充填したプラスチック製のパスツールピペットを使用してスライスを収集し、お風呂からティッシュをそっとつかみます。必要に応じて、鉗子とスプリングハサミを使用して、組織がまだ付着している場合は、スライスをハートブロックから切り離します。
- スライスを酸素化Tyrodeの浴(ステップ1.7を参照)の1つの細胞ストレーナーに移し、プラスチックパスツールピペットの液体を使用して組織を細胞ストレーナーの1つに平らに置き、上部に金属ワッシャーを追加して組織を押さえます。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アガロース | バイオラインUSA | バイオ-41025 | |
| 2,3-ブタンジオン一酸素(BDM) | 漁夫 | AC150375000 | |
| 塩化カルシウム(CaCl2) | 漁夫 | C79-500 | |
| 振動ミクロトーム用セラミックブレード | カムデン・インストゥルメンツ | 7550-1-C | |
| D-グルコース | 漁夫 | D16-1 | |
| 使い捨てメス #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, コーニング | VWRの | 21008-952 | |
| ヘパリンナトリウム塩 | シグマ・アルドリッチ | H3149-50KUさん | |
| ヘープス | 漁夫 | BP310-1 | |
| ヒストアクリルBLUEティッシュ接着剤 | アマゾン | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| アイリススプリングハサミ | 漁夫 | NC9019530 | |
| アイリスストレートハサミ | 漁夫 | 731210 | |
| 塩化マグネシウム(MgCl2) | 漁夫 | M33-500 | |
| 酸素レギュレータ | プラクスエアー | ||
| 酸素ボンベ | プラクスエアー | ||
| プラスチックパスツールピペット | 漁夫 | 13-711-48 | |
| 塩化カリウム(KCl) | 漁夫 | AC193780010 | |
| カミソリ長方形の刃 | 漁夫 | 12〜640 | |
| 格納式メス | 漁夫 | 22-079-716 | |
| 重炭酸ナトリウム(NaHCO3) | 漁夫 | AC217125000 | |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | 漁夫 | AC327300010 | |
| 振動ミクロトーム | カムデン・インストゥルメンツ | 7000 SMZ-2 |
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