ブタ卵管卵子複合体の単離:体外受精のためのブタ卵巣卵胞から卵雲卵母細胞複合体を単離する技術

要約

出典:Gorczyca, G. et al., ブタ卵母細胞カプセル化のためのタンパク質分解分解アルギン酸ヒドロゲルおよび疎水性マイクロバイオリアクター。

このビデオでは、ブタの卵巣から卵丘-卵母細胞複合体またはCOCを分離する技術について説明しています。単離された無傷のCOCは、不妊治療を開発するための生殖補助技術である体外受精を実施するために使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ブタ積雲-卵母細胞複合体の分離

1. 卵巣卵胞の単離のための材料を収集するために、地元の食肉処理場で思春期前の雌豚(生後約6〜7ヶ月、体重70〜80 kg)からブタの卵巣を採取します。各実験で卵丘卵母細胞複合体(COC)を単離するために、10匹の動物から約20個のブタ卵巣を選択します.
   手記：各卵巣が3〜5個の卵胞を産むと仮定すると、卵胞の総数は60〜100個です。
2. 1%抗真菌溶液(AAS)を含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS;pH 7.4;38°C)の入った魔法瓶に卵巣を入れます。実験材料が1時間以内に実験室に輸送され、抗生物質を含む滅菌PBSで2回すすがれることを確認してください。
3. 卵巣をすすぎた後、取り扱い培地(HM)(Table of Materials)で満たされたビーカーに移し、すべての操作の時間のために38°Cのインキュベーターに保管します
   手記：卵子の取り扱い中に最適な結果を得るには、2.5%の抗生物質/AASと10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM/F12培地(取り扱い培地、HM)ですべての手順を実行し、環境中の_CO2レベルでpHを制御し、温度制御付き加熱テーブル(38°C)と層流フードの下で細菌汚染を最小限に抑えます。
4. 大きなブタの卵胞(直径6〜8 mm)から、吸引および遠心分離により卵胞液(FF)を100 x gで室温で10分間収集します。その後、0.2μmのメンブレンポアフィルターに取り付けた滅菌シリンジを用いて上清を濾過し、-80°Cでスナップ凍結します
   手記：卵胞液の吸引にはインスリン注射器(u-40)を使用します。
5. 健康な中型の卵胞(直径4〜6 mm)のみがCOCの分離に選択されていることを確認してください><。 手記：グレードIのCOCは、均質な卵形質と多層(少なくとも3-4)のコンパクトな積雲を持つ無傷の丸い卵子を持ち、さらなる3D IVM手順に適していると考えられています。
6. COCを分離するには、HMで満たされた直径10cmの滅菌シャーレに2〜3個の卵巣を移します。
   1. 突き出た卵巣卵胞の表面を滅菌外科用ブレード15Cで優しく切ります。これにより、COCとともに卵胞液がペトリ皿に流出します。
   2. 使い捨て注射器に取り付けられた5/8インチのサイズの28G針を使用して卵胞の内容物を吸引し、ペトリ皿に移します
      手記：卵巣組織の残骸を捨てます。その後の単離段階は、実体顕微鏡下で行われます。
7. 3〜5個の60mmIVFペトリ皿を準備します。
   1. 中央のウェルに1mLのHMを加え、3〜4滴のHM(1滴あたり50μL)を外側のリングに入れます。
   2. 次に、ポリカーボネートマイクロピペットを使用して、損傷していないCOCを外輪のHM滴に移し、3〜4回短時間すすぎます。
   3. 最後に、それらを個別に中央の井戸に移します。これらのIVFプレートは、さらなる手順のためにインキュベーターに保管してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
全般
抗生物質 抗真菌薬 (100x) 100ml	サーモフィッシャー	15240062	ハンドリング媒体の最終濃度は 2.5%、PBS 中濃度は 1% (ステップ 1.2)
DMEM/F12 (500ミリリットル)	シグマ・アルドリッチ	D8062	ハンドリング媒体
FCS(100 ml)	サーモフィッシャー	16140063	ハンドリング媒体の最終濃度は10%です。(ステップ:1.5)
PBS(1x、pH 7.4)500ml	サーモフィッシャー	10010023
成熟媒体
hCG (10,000 Uの1バイアル)	シグマ・アルドリッチ	CG10
PMSGの	バイオベンダー	RP1782721000
特定の機器、ツール
30 mm プテリ皿	TPPとは	93040
60 mm IVFシャーレ	隼	353653
孵卵器	パナソニック	MCO-170AIC-PE	他のブランドも使用可能
滅菌ペトリ皿(10 cm)	NESTバイオテクノロジー	704002
魔法瓶	ケチュア語	5602589	他のブランドも使用可能

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