Liquid Marble Microbioreactor System:ブタ卵母細胞のカプセル化のための3D培養プロトコール

要約

出典:Gorczyca, G., et al. ブタ卵母細胞カプセル化のためのタンパク質分解分解アルギン酸ヒドロゲルと疎水性マイクロバイオリアクター。

このビデオでは、ブタの卵子を疎水性マイクロバイオリアクターにカプセル化するためのプロトコルについて説明します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 超疎水性フッ素化エチレンプロピレン(FEP)マイクロバイオリアクターへのカプセル化。

>注:すべての体外成熟(IVM)手順がサーモスタット制御されたテーブルで実行され、積雲卵母細胞複合体(COC)が取り扱い全体で38°Cに維持されていることを確認してください。

1. 5 gのFEP粉末を含む30 mmのシャーレを準備します-ベッド平均粒子サイズは1μm
   注:新鮮なFEPパウダーを使用することが重要です。再利用されたFEPは、凝集して塊を形成する傾向があります。
2. 3〜5個のCOCを含む成熟培地(MM)(容量~30μL)の1滴をFEP粉末のベッドに分配します。プレートを円を描くようにゆっくりと回転させて、これらの粒子が液滴と形成された液体ビー玉(LM)の表面を完全に覆っていることを確認します。
3. 1,000 μLチップのピペットを使用して形成されたLMをピックアップします.
   注意: ピペットチップの端をカットして、LMの直径(4〜5 mm)に収めます。このような準備された先端のおおよその直径は、LMの直径よりもわずかに大きくする必要があります。
4. 60mmの体外受精(IVF)シャーレを数枚用意します。外輪に3〜4mLの滅菌水を加えて、湿度チャンバーを準備します。次に、1つのLMを中央の井戸に入れます.
   注:この手順には優れた手作業のスキルと精度が必要です-大理石が不注意に置かれたり、低い高さからでも落下したりすると、大理石は破壊されます。
5. ビー玉を5% CO₂インキュベーターで38°Cで4日間インキュベートします。
   1. 手順に従って毎日培地を交換してください:各LMに30μLのMMを塗布しますが、直接液体に接触するとコーティングされたFEP粉末の疎水性が乱れるため、LMが広がります。大理石の内容物が溶解したら、バイオリアクターから放出されたCOCをペトリ皿内の新鮮なMMの滴に移します
      注:放出されたCOCを正確に移すには、ポリカーボネートマイクロピペットを使用してください。
   2. MMで数回洗浄(3〜4回)してFEP粒子を除去した後、30μLの新鮮なMMでFEP粉末床に移します。プレートを円を描くようにゆっくりと回転させて、粉末粒子が液滴の表面を完全に覆い、新しいLMを形成するようにします。
   3. 形成されたLMを、チップが1,000 μLのピペットでピックアップします。
   4. 外輪に3〜4mLの滅菌水を加えて、湿度チャンバーを準備します。次に、1つのLMをIVFシャーレの中央ウェルに入れます.
      注:FEP粉末の透明コーティングにより、光学顕微鏡を使用してLM含有量を監視できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
成熟媒体
hCG (10,000 Uの1バイアル)	シグマ・アルドリッチ	CG10
PMSGの	バイオベンダー	RP1782721000
DMEM/F12 (500ミリリットル)	シグマ・アルドリッチ	D8062	成熟媒体
FCS(100 ml)	サーモフィッシャー	16140063	成熟培地の最終濃度10%
液体大理石
FEPの	ダイネオンGmbH 3M AdMD	A-66670
特定の機器、ツール
30mmシャーレ	TPPとは	93040
60 mm IVFシャーレ	隼	353653
Ez-Gridプレミアムセルハンドリングピペッター	RIライフサイエンス	8-72-288
EZ-チップ	RIライフサイエンス	8-72-4155/20
孵卵器	パナソニック	MCO-170AIC-PE	他のブランドも使用可能
滅菌ペトリ皿(10 cm)	NESTバイオテクノロジー	704002