ブタ角膜内皮細胞のレーザー支援選択的アブレーション:Ex Vivo研究のための焦点性ブタ角膜内皮損傷を誘発する技術

要約

出典: Holzhey, A. et al., Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、ブタの眼の角膜内皮細胞を選択的に損傷する非侵襲的なレーザー支援手順を示しています。開発された内皮細胞損傷のex vivoモデルは、角膜内皮の疾患を研究するために使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 臓器培養とレーザー治療の準備

1. 地元の食肉処理場から摘出されたばかりの豚の目を入手してください。L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%)、ブタ血清(10%)を添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で冷やします(4°C)ので、この記事ではフル培
地と呼びます。
2. ハサミで細胞外組織を取り出し、目を5%ポビドンヨード点眼液に5分間浸してから、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に使用まで入れます。
3. 角膜瘢痕化、浮腫、その他の混濁などの主要な前眼部の病状を、スペクトル領域光干渉断層撮影装置でスクリーニングします(材料表)。
4. 波長1,064nm、焦点径10μmのNd:YAGレーザーを搭載したスリットランプユニット(材料表)の前に目を置きます。
   手記：最適な位置決めのために、3Dプリントされた保持装置が使用されており、これは目をしっかりと保持するように設計されており、圧力をかけすぎないようになっています(図1)。
5. 12倍の倍率を使用し、照明を偏向させて個々の角膜層を視覚化します。
6. 内皮細胞の選択的アブレーションのために、パルスエネルギー(例:1.6 mJ)と焦点点(例:0.16 mm)を設定します。
7. 透明な角膜穿刺を輪部の近くに置き、粘弾性体(Table of Materials)を注入して前房を安定させます。
8. レーザー処理した角膜中央部を8mmのトレフィンで切除します。
9. 切除した角膜を内皮部位が上を向くようにして12ウェルプレートのウェルに入れ、37°Cの3 mLのフルメディウムで最大3日間インキュベートします
   手記：このステップでは、潜在的な細胞保護剤を培地に添加することができます。

結果

図1:実験のセットアップ。(A)目は部分的に3Dプリントされた保持装置に固定され、レーザービームに対して正確な位置合わせが可能になった。(B)レーザー治療の前に、組織を前方セグメント光干渉断層撮影装置で評価し、主要な前方セグメントの病状を確認しました。焦点レーザー点の位置は、0.0 mm(黒のアスタリスク)、0.1 mm(赤のアスタリスク)、および0.2 mm(青のアスタリスク)の例示で示されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バロン真空トレフィン	カテナ	品番:K20-2058
クライオスタット	ライカ	CMの3050S
ダルベッコのモディファイドイーグルズミディアム-高グルコース	PAAの	E-15009
アイホルダー	自己	該当なし
倒立顕微鏡	ライカ	DMI 6000 B
KH2PO4	メルク	529568
Na2HPO4	メルク	1065860500
Nd:YAGレーザー	ツァイスメディテック	visuLAS YAG II プラス
OCTティッシュテック	さくらファインテクニカル	4583
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマ・アルドリッチ	P4333
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ギブコ	10010056
ブタ血清	シグマ・アルドリッチ	12736C
スペクトル領域光コヒーレンストモグラフ	ハイデルベルクエンジニアリング	スペクトラリス
組織培養プレート 12ウェル	ザルシュテット	833921
粘 弾性	オムニビジョン	メトセル

名